铜离子通过TGFβ/Smads通路调控草鱼timp2基因促进肌肉胶原沉积的机制研究

本研究针对养殖草鱼肌肉品质下降问题，通过细胞模型揭示Cu2?通过激活TGFβ/Smads信号通路上调timp2表达，抑制mmp2介导的胶原降解，显著提升胶原含量。该发现为通过营养调控改善水产品质提供了新策略。

　　

随着集约化养殖的发展，草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肌肉品质呈现下降趋势，特别是肌肉硬度与口感显著劣化。肌肉硬度作为衡量鱼类食用品质的关键指标，主要取决于肌原纤维和结缔组织的构成，而胶原蛋白作为结缔组织的主要成分，其含量与代谢平衡直接决定肌肉质地。近年来研究表明，胶原代谢的动态平衡受合成酶（如脯氨酰羟化酶PHD）和降解酶系统共同调控，其中基质金属蛋白酶（MMPs）及其特异性抑制剂（TIMPs）发挥着核心作用。尽管TIMP2已被证实是胶原降解过程的关键调控因子，但其在鱼类肌肉中的作用机制及上游调控通路仍不明确。

值得注意的是，微量元素铜（Cu）在胶原生物合成中扮演重要角色。既往研究显示膳食铜可提升草鱼肌肉中TGFβ信号通路相关蛋白（TGFβ1、p-Smad2、Smad3和Smad4）的表达水平，并增加胶原含量，然而铜离子是否通过调控胶原降解途径影响肌肉品质尚属未知。为此，中国海洋大学的研究团队在《Food Chemistry: Molecular Sciences》发表论文，系统探究了Cu2?通过TGFβ/Smads信号通路调控timp2表达影响草鱼肌肉胶原沉积的分子机制。

研究采用多学科交叉技术方法：首先通过组织块培养法建立草鱼肌肉成纤维细胞体外模型，采用RT-PCR检测细胞标志物（pax-7、desmin、tcf-4）进行细胞类型鉴定；利用siRNA特异性沉默timp2基因；使用CCK-8法筛选Cu2?最佳作用浓度；通过ICP-OES测定细胞内铜离子浓度；采用天狼星红染色定量胶原含量；运用qPCR和Western blot分别检测基因和蛋白表达水平；使用TGFβ/Smads通路特异性抑制剂SB431542进行机制验证。

3.1. 草鱼timp2基因的鉴定与特征分析

研究人员成功克隆获得长度为657bp的timp2开放阅读框，编码218个氨基酸。序列分析显示其与鲂（Megalobrama amblycephala）相似度达90%，与哺乳动物（人、鼠）相似度约58%。系统进化树分析证实草鱼TIMP2与其他鱼类聚为一支，与哺乳动物分支明显分离。三级结构预测显示其具有典型的NTR功能域结构。

3.2. 成纤维细胞培养与鉴定

原代培养27天后获得纯度较高的成纤维细胞，RT-PCR检测显示细胞表达成纤维细胞标志物tcf-4，而不表达成肌细胞标志物pax-7和desmin，证实所获细胞为成纤维细胞系。

3.3. timp2基因沉默对胶原代谢的影响

通过siRNA干扰筛选发现siRNA-186可显著降低timp2表达达53.8%。基因沉默后，胶原含量下降至对照组90.2%，col1a1和col1a2表达显著下调，mmp2表达上调33.1%，而col5a1表达无显著变化，表明timp2特异性调控I型胶原代谢。

3.4. Cu2?对胶原代谢的浓度效应

细胞毒性试验显示10μM Cu2?为最佳作用浓度。在此浓度下，胶原含量、col1a1、col1a2、col5a1和timp2表达均显著上调，mmp2表达则显著抑制。细胞内铜浓度测定证实Cu2?被有效摄入。

3.5. Cu2?逆转timp2沉默效应

在timp2沉默细胞中补充10μM Cu2?，可显著逆转胶原含量下降趋势，恢复col1a1、col1a2和timp2表达水平，并抑制mmp2过度表达，证明Cu2?通过调控timp2影响胶原代谢。

3.6-3.8. TGFβ/Smads通路机制验证

Cu2?处理显著激活TGFβ/Smads通路，上调tgfb1、smad2、smad3、smad4基因表达及Smad2/Smad3磷酸化水平。使用通路抑制剂SB431542可消除Cu2?对胶原代谢的促进作用，而补充Cu2?又能逆转抑制剂效应，证实Cu2?通过TGFβ/Smads-timp2轴调控胶原沉积。

研究结论表明，Cu2?通过激活TGFβ/Smads信号通路，上调timp2表达并抑制mmp2活性，从而减少胶原降解、促进胶原沉积。该机制解析不仅深化了对鱼类胶原代谢调控的理解，也为通过膳食铜营养策略改善养殖草鱼肌肉品质提供了重要理论依据。值得注意的是，本研究发现的10μM Cu2?最佳作用浓度与细胞内铜浓度3.21ng/10?细胞的对应关系，为后续体内试验的剂量设计提供了精准参考。尽管研究聚焦于降解途径，但Cu2?对胶原合成途径（如LOX酶激活）的潜在协同作用，以及TIMP家族其他成员对V型胶原的调控机制，仍需进一步探究。