基于DNA甲基化的法医框架：利用纳米孔测序技术进行年龄预测和体液鉴定

《Forensic Science International: Genetics》：DNA Methylation-Based Forensic Framework for Age Prediction and Body Fluid Identification Using Nanopore Sequencing

表观遗传学方法评估纳米孔测序在年龄估算和体液识别中的应用，通过PromethION 2平台单次实验分析DNA甲基化标记。结果显示低测序深度（<100 ng DNA）易导致β值极端（0或1），系统过估年龄（MAE=15.9-20.5年），经线性转换模型修正后MAE降至8.3-4.2年。体液识别方面，血液和唾液在高低测序深度下均能准确分类（4/4样本），但精液和阴道分泌物需进一步研究。方法创新性在于单次实验同时检测年龄和体液特征，未来需优化低样本性能并开发混合样本分析模型。

　　在现代法医学研究中，DNA表型分析技术正逐步成为一种重要的工具，用于在传统DNA鉴定方法无法提供有效信息的情况下，对犯罪现场的嫌疑人或受害者进行推断。这一技术主要依赖于遗传标记和表观遗传标记，包括DNA甲基化模式，从而推断出个体的生物地理祖先、外显性特征（如身高、发色等）以及生物年龄。DNA甲基化作为表观遗传修饰的一种形式，不仅对年龄估计具有重要意义，还因其在不同组织中的特异性模式，成为体液鉴定的关键工具。体液的准确鉴定对于重建犯罪现场场景具有重要的辅助作用。

当前的DNA甲基化分析通常依赖于大规模并行测序（MPS）技术，这种技术虽然在某些方面具有优势，但其流程复杂且需要多步骤处理，导致时间和成本的增加。同时，MPS技术需要对DNA进行转换处理，这可能引入额外的DNA降解和技术问题，如转换效率不佳。为了解决这些问题，Nanopore测序技术作为一种新兴的替代方案，因其能够在不经过DNA转换的情况下实现实时、直接的甲基化检测而备受关注。Nanopore测序技术能够直接分析DNA分子，无需复杂的预处理或扩增步骤，这一特性使其在处理微量DNA样本时更具优势。

本研究旨在评估Nanopore的PromethION 2平台在法医学中分析DNA甲基化标记的潜力，特别是针对生物年龄估计（如表观遗传时钟）和体液鉴定。研究关注了相对较低DNA量的样本（<100 ng），并探讨了PromethION平台在不同实验条件下的表现。研究结果显示，低读深度覆盖可能导致某些甲基化状态（如甲基化程度为零或一）的beta值出现，而这些值在甲基化连续性背景下显得异常，可能影响年龄估计和体液鉴定的准确性。然而，通过应用一个概念验证的线性校正模型，年龄估计的准确性得到了显著提高。此外，对于血液和唾液的体液鉴定，即使在低读深度条件下，其准确性仍然很高，达到了4/4样本的正确识别率。

本研究采用了多种实验设计，包括Sheared Adaptive Sampling (ShAS)、Adaptive Saliva (AS) 和 Low Quantity Adaptive Sampling (LQAS)。在这些实验中，研究者使用了不同的DNA输入量和实验条件，以评估PromethION平台在不同情况下的表现。实验结果表明，尽管在某些情况下甲基化值的极端情况（如零或一）可能影响预测结果，但通过调整读深度和应用校正策略，能够有效提升年龄估计和体液鉴定的准确性。此外，研究还发现，尽管某些甲基化标记在低读深度下可能无法提供足够的信息，但总体而言，PromethION平台在处理微量DNA样本时表现出一定的潜力。

研究还探讨了不同类型的表观遗传时钟模型，如Horvath时钟和VISAGE时钟，以及它们在PromethION数据中的表现。Horvath时钟由353个CpG位点组成，覆盖了多种组织，而VISAGE时钟则针对特定的法医学应用，如血液样本的年龄估计。研究发现，尽管Horvath和VISAGE模型在某些情况下可能系统性地高估年龄，但通过应用线性校正模型，可以显著减少这种误差。在LQAS实验中，校正后的MAE从15.9年降至8.3年；在ShAS实验中，MAE从20.5年降至4.2年。这些结果表明，线性校正模型对于提高年龄估计的准确性具有重要意义。

对于体液鉴定，研究者使用了16个已知的甲基化标记，并将其与文献中的参考值进行了比较。结果表明，尽管某些标记在低读深度下可能表现出较大的差异，但整体上PromethION平台在体液鉴定方面仍具有良好的表现。例如，在ShAS和AS实验中，血液和唾液的鉴定准确率较高，显示出PromethION在体液鉴定方面的潜力。然而，对于其他体液如精液和阴道分泌物，其甲基化值的差异相对较大，表明需要进一步优化这些标记的检测方法。

此外，研究还探讨了PromethION测序的重复性和稳定性。在LQAS和ShAS实验中，重复样本的分析结果显示，测序深度和孔隙可用性对结果的准确性至关重要。低读深度可能导致年龄高估，而高读深度则有助于提高预测的可靠性。尽管如此，研究者发现，在某些情况下，即使读深度较高，某些标记仍然表现出较大的差异，这可能与样本的基因背景或环境因素有关。因此，未来的研究需要进一步优化这些标记的检测方法，并开发针对PromethION数据的特定模型，以提高其在法医学中的应用效果。

本研究的结论表明，Nanopore测序技术，特别是PromethION平台，具有在法医学中进行DNA表型分析的潜力。然而，为了更好地满足法医学的实际需求，还需要进一步优化测序流程，提高孔隙的可用性和健康度，减少DNA损失，并开发针对PromethION数据的特定模型。这些改进措施将有助于提高DNA甲基化分析在微量样本中的准确性，从而提升法医学在犯罪现场分析中的应用效果。尽管存在一些挑战，但PromethION平台的潜力不容忽视，其在法医学中的应用前景广阔。