Trem2-Dap12-Syk-PI3K信号轴通过调控Insl3表达介导隐睾症发病的新机制

本研究针对隐睾症中胰岛素样因子3（Insl3）表达下降的机制不明问题，通过构建Trem2?/?小鼠模型并结合人类睾丸组织体外培养实验，发现巨噬细胞表面受体Trem2通过Dap12-Syk-PI3K信号通路调控Insl3表达，揭示Trem2缺失导致炎症因子失衡和Leydig细胞功能障碍，从而阐明了隐睾症发病的新机制，为临床治疗提供了潜在靶点。

　　

隐睾症作为最常见的先天性泌尿生殖系统异常之一，影响着1%-9%的男性新生儿。虽然研究表明Leydig细胞分泌的胰岛素样因子3（Insl3）在睾丸下降的初始阶段起着关键作用，但关于Insl3表达降低的致病机制仍知之甚少。更令人困惑的是，仅有少数孤立性人类隐睾病例可归因于INSL3或RXFP2基因突变，这表明在睾丸下降过程中调控Insl3表达的未知信号通路亟待探索。

近年来，研究人员逐渐认识到睾丸内巨噬细胞与Leydig细胞之间的密切交流对维持睾丸微环境稳态至关重要。睾丸间质区内，巨噬细胞是仅次于Leydig细胞的第二大细胞组分，它们通过复杂的细胞质延伸与Leydig细胞相互交错，实现高效的细胞通讯。这种交流部分通过巨噬细胞嵌入Leydig细胞，传递关键的细胞因子信号，包括转化生长因子-β（TGF-β）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和集落刺激因子-1（CSF-1）等。研究表明，巨噬细胞耗竭会导致Leydig细胞数量显著减少，而巨噬细胞重新 populate 后这种效应会被逆转，证明了巨噬细胞与Leydig细胞在维持睾丸平衡中的关键作用。

在这项发表于《Genomics》的研究中，Songyi Ye等人将目光投向了髓样细胞表达的触发受体2（Trem2），这是一种巨噬细胞表面受体， critically 调节免疫调节、细胞活力维持、吞噬活性和脂质代谢调节等多个细胞过程。基于课题组前期的RNA测序数据，研究人员假设Trem2可能是睾丸下降过程的核心调节因子。

为验证这一假设，研究人员开展了系统性研究，主要技术方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Trem2^?/?小鼠模型；采集人类隐睾患儿（6例）和对照组（3例）睾丸组织样本；建立人类胎儿睾丸组织（孕8-13周）体外培养体系；采用免疫组织化学、免疫荧光和Western blot等技术进行蛋白表达定位与定量分析；通过间接共培养系统研究巨噬细胞与Leydig细胞的相互作用；使用计算机辅助精子分析（CASA）评估精子活力参数。

研究结果方面，通过差异表达基因分析发现，与健康对照组相比，隐睾患儿睾丸中Trem2表达显著下调。在Trem2^?/?小鼠中，63.16%的雄性后代出现隐睾，并伴有精子活力和形态异常，同时Leydig细胞数量和Insl3表达降低。体外实验显示，Trem2表达与Insl3表达呈正相关。机制上，酮康唑（KET）通过抑制Trem2-Dap12-Syk-PI3K轴升高TNF-α，最终破坏Leydig细胞总数和Insl3表达。

具体而言，在"Trem2缺失诱导小鼠隐睾模型"中，研究人员发现Trem2^?/?雄性小鼠不仅隐睾发生率高，还表现出体重减轻、睾丸指数下降和肛门生殖距离缩短等生殖发育异常。在"Trem2敲除雄性小鼠显示睾丸结构破坏和精子形态活力异常"部分，组织学分析显示隐睾小鼠睾丸出现生精小管变薄变形、间质组织和基底膜增厚、生精小管内空泡样变等结构异常，精子头部畸形显著增加。

关于"Trem2敲除雄性小鼠显示Leydig细胞群减少和Insl3水平降低"，免疫荧光分析证实F4/80⁺巨噬细胞和HSD3B1⁺ Leydig细胞在某些区域密切接触，为它们的交流提供了结构基础。Trem2^?/?隐睾小鼠显示HSD3B1⁺ Leydig细胞群减少，胚胎期睾丸中Insl3表达显著下调。

在"Trem2与Insl3表达在体外人类睾丸培养中呈正相关"实验中，人类胎儿睾丸组织体外培养表明，KET刺激导致Trem2和Insl3表达降低，而LH刺激使两种蛋白表达增加，相关性分析显示Trem2和Insl3表达呈强正相关。

进一步机制探究"Trem2通过抑制炎症细胞因子促进Leydig细胞增殖和Insl3表达"发现，巨噬细胞条件培养基可增强TM3细胞增殖，但KET处理削弱这种效应。Trem2沉默损害TM3细胞增殖并加剧KET诱导的抑制，而用HSP60激活Trem2可挽救TM3细胞增殖。细胞因子分析显示KET刺激巨噬细胞增加促炎细胞因子TNF-α和IL-1β分泌，降低抗炎细胞因子TGF-β和CSF-1。TNF-α处理TM3细胞降低Insl3表达并减少其增殖能力。

最后，在"Dap12-Syk-PI3K信号参与Trem2缺失介导的隐睾症"部分，研究表明Trem2缺失抑制Dap12-Syk-PI3K通路，免疫组化证实隐睾小鼠睾丸中Dap12、Syk和PI3K表达降低。体外实验显示KET抑制Trem2-Dap12-Syk-PI3K通路组分表达，而Trem2激活或过表达可挽救KET诱导的这些分子抑制。免疫共沉淀显示Dap12和Syk直接相互作用，免疫荧光显示RAW264.7细胞中Trem2、Dap12和Syk共表达。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示Trem2-Dap12-Syk-PI3K轴作为睾丸巨噬细胞-Leydig细胞通讯中的关键效应通路，通过调节Insl3表达影响睾丸下降过程。Trem2缺失通过抑制Dap12/Syk/PI3K信号级联，触发免疫激活，表现为促炎细胞因子上调和抗炎细胞因子分泌下调，最终损害Leydig细胞活力和功能，导致隐睾症发生。

值得注意的是，尽管Trem2缺失导致隐睾率升高，但Trem2^?/?对照小鼠的生育力没有显著受损，这可能涉及替代信号通路（如TAM受体、Gas6/ProS或PD-1/PD-L1通路）的补偿机制，这些系统可能补偿巨噬细胞功能缺失，帮助维持免疫-睾丸稳态。

研究的局限性包括：全身性Trem2^?/?小鼠的使用不能明确将观察到的表型归因于睾丸巨噬细胞；虽然人类胎儿组织分析支持临床相关性，但需要更大的患者队列来验证这些关联；在Trem2^?/?小鼠中观察到的生精缺陷可能源于Trem2敲除本身或隐睾的继发后果。

总之，这项研究不仅为隐睾症的发病机制提供了新的见解，揭示了Trem2在巨噬细胞-Leydig细胞串扰中的关键作用，还为开发针对Trem2-Dap12-Syk-PI3K信号通路的治疗策略奠定了理论基础，对未来隐睾症的预防和治疗具有重要的临床意义。