单细胞RNA测序数据中线粒体DNA同质与异质性SNVs精准识别新流程的开发与应用

本研究针对单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中线粒体DNA（mtDNA）单核苷酸变异（SNVs）检测可靠性不足的问题，开发了一套包含质量控制、比对、SNV calling及注释的新型生物信息学流程。该流程通过定制化覆盖度阈值识别异质性SNVs，有效过滤测序错误、链偏好性错误和RNA修饰诱导错误，成功实现了同质性与异质性mtDNA SNVs的高精度检测，为线粒体相关疾病机制研究提供了重要技术支撑。

　　

线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的突变与多种疾病密切相关，尤其在肌肉、大脑等高能量需求组织中表现突出。这些突变通常以单核苷酸变异（single nucleotide variants, SNVs）的形式存在，并可分为同质性（homoplasmic，所有mtDNA分子携带相同突变）和异质性（heteroplasmic，仅部分mtDNA分子携带突变）两种类型。理解这些SNVs在单细胞水平的分布与特征，对于揭示其致病机制和临床表现形式至关重要。尽管目前已有大量公开的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，但现有分析流程在从scRNA-seq数据中可靠检测mtDNA SNVs方面仍存在明显不足，例如难以有效区分真实变异与测序错误、链偏好性偏差以及RNA修饰引入的人工假象。

为应对这一挑战，研究人员开发了一套新型生物信息学流程，专门用于从scRNA-seq数据中识别同质性和异质性mtDNA SNVs。该流程整合了质量控制、线粒体基因组比对、SNV calling和注释等多个步骤，并特别设计了针对测序错误的过滤策略。其中，覆盖度依赖性阈值可自定义，以灵敏捕捉低频率异质性SNVs；重复读段（duplicate reads）被保留，因研究证实多数为真实生物重复；此外，通过剔除链偏好性错误（阈值设定为链比例超过1:3）、RNA修饰诱导错误（同一位置存在多个替代等位基因）以及过度表达的SNVs，显著提升了检测准确性。

该研究已发表于《Genomics》，其核心方法包括：利用公共scRNA-seq数据集（未注明具体队列来源），通过比对至线粒体基因组（参考序列为GRCh38）实现读段定位；采用GATK等工具进行SNV calling；设置覆盖度阈值识别异质性SNVs（最低频率阈值可调）；并基于生物信息学规则过滤系统误差。

质量控制与比对

研究团队首先对原始scRNA-seq数据实施严格质控，去除低质量读段和接头序列。随后，将清洁读段比对至人类线粒体基因组，确保高特异性映射率，为后续SNV分析奠定基础。

SNV Calling与错误过滤

在SNV检测阶段，流程采用灵敏度较高的caller初步识别候选位点，并通过覆盖度依赖性阈值区分同质性与异质性SNVs。为减少假阳性，研究人员开发了多层级过滤策略：排除链偏好性显著偏离1:3比例的位点；剔除同一位置存在多个替代等位基因的位点（提示RNA修饰干扰）；移除在多个细胞中过度重复出现的SNVs（可能源于扩增偏差）。

注释与功能分析

最终通过的SNVs经注释工具解读其潜在功能影响，如是否位于编码区或改变氨基酸序列，从而评估其生物学意义。

研究结论表明，该流程能高效、可靠地从scRNA-seq数据中检测同质性与异质性mtDNA SNVs，解决了现有方法误差率高、灵敏度不足的问题。讨论部分强调，这一工具为利用公共scRNA-seq资源研究线粒体遗传变异提供了标准化方案，尤其适用于能量代谢疾病（如线粒体肌病、神经退行性疾病）的机制探索，未来有望推动精准医学中线粒体变异检测的临床应用。