日本囊对虾沙潜行为受限的scRNA-seq分析揭示血细胞分子应激机制

本研究针对日本囊对虾（Penaeus japonicus）沙潜行为受限的应激响应机制，通过单细胞转录组测序技术解析血细胞亚群的分子特征。研究人员设计三种养殖系统（沙底组、无沙组及无沙应激组），发现6小时为关键应激响应时间点，鉴定出13个血细胞亚群并验证其标记基因。研究揭示TRP通道基因（trpa1、trpm）和cut蛋白家族在行为调控中的重要作用，为水产养殖行为应激管理提供理论依据。

　　

日本囊对虾（Penaeus japonicus）作为重要的经济水产种类，其独特的沙潜行为既是自然习性，也成为规模化养殖的制约因素。在集约化养殖环境中，底质条件的改变会导致对虾自然行为受限，进而引发应激反应，影响生长存活。然而，目前对于沙潜行为受限的分子响应机制，特别是免疫细胞层面的调控网络仍不明确。

为深入解析这一科学问题，由张慧敏领衔的研究团队在《Genomics》发表了创新性研究。该研究通过构建三种实验养殖系统：沙底对照组、持续无沙组以及短期应激组（沙底饲养1周后转移至无沙环境），采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术结合分子生物学验证手段，系统揭示了日本囊对虾血细胞在行为受限条件下的转录组响应特征。

研究主要采用以下关键技术方法：1）基于10x Genomics平台的单细胞转录组测序技术，对三组实验对虾血细胞进行转录本检测；2）通过qRT-PCR对热休克蛋白HSP60和昼夜节律基因（period、timeless）进行时间序列表达分析，确定关键应激时间点；3）利用RNA原位杂交技术对血细胞标志基因进行空间定位验证；4）采用生物信息学方法对细胞亚群进行聚类分析和差异基因筛选。

研究结果主要体现在以下四个方面：

关键应激时间点的确定

通过应激相关基因（HSP60）和昼夜节律基因（period、timeless）的表达模式分析，发现转移至无沙环境后6小时（6 h post-transition）呈现最显著的应激响应（p<0.05），该时间点被确定为后续单细胞转录组分析的关键采样时段。

血细胞亚群的精细鉴定

研究成功检测到25,371个高表达基因，通过聚类分析将血细胞划分为13个 distinct细胞亚群。通过人工注释将其归类为5种功能细胞类型：颗粒细胞（granular cells, GCs）、半颗粒细胞（semi-granular cells, SGCs）、透明细胞（hyaline cells, HCs）、原血细胞样细胞（prohemocyte-like cells）以及功能细胞（functional cells）。

标记基因的验证与定位

通过qRT-PCR技术验证了13个在GCs、SGCs和HCs中高表达的标志基因。进一步采用RNA原位杂交技术成功将pxt、IGSF10和IFI30基因分别定位于GCs、HCs和SGCs，证实了基于标记基因的细胞分群准确性。

差异表达基因的功能解析

单细胞转录组差异表达分析显示三组实验对虾之间存在显著基因表达差异（p<0.05）。大多数差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）集中在簇2（GCs）和簇8（HCs），表明这两类细胞与沙潜行为调控密切相关。通过组间比较分析，鉴定出包括trpa1、trpm等TRP通道基因和cut蛋白家族在内的关键候选DEGs，这些基因可能在环境变化响应和自然行为限制中发挥重要作用。

研究结论表明，日本囊对虾血细胞对沙潜行为受限的应激响应具有高度细胞类型特异性，其中颗粒细胞和透明细胞是调控响应的主要细胞类型。TRP通道基因家族和cut蛋白家族可能通过感知环境刺激和调控神经信号传导参与行为应激响应。该研究不仅为理解甲壳动物行为应激的分子机制提供了单细胞水平的见解，也为水产养殖环境优化和动物福利管理提供了重要理论依据。研究者建议未来通过功能验证实验进一步阐明TRP通道和cut蛋白家族在行为调控中的具体作用机制，为选育适应集约化养殖的对虾新品种提供分子靶点。