外源性尿调节素通过调节肾小管反应减轻草酸盐诱导的肾损伤的机制研究

本研究揭示了外源性尿调节素（Uromodulin, Umod）在草酸盐诱导的肾损伤模型中对肾小管反应的保护作用。通过体内外实验证实，Umod能显著减轻钠草酸盐（NaOx）引起的肾小管损伤、晶体沉积及炎症反应，并抑制细胞凋亡通路（如caspase-8）。该发现为晶体性肾病（如肾结石）的治疗提供了新靶点，并支持尿Umod作为肾脏健康生物标志物的潜力。

　　

引言

晶体性肾病是由矿物质（如钠、钙）和草酸盐局部过饱和引发的肾脏疾病，常导致晶体形成和结石生成。根据Anders等人的分类，晶体性肾病可分为血管晶体病、肾小管晶体病和尿路结石三类。年龄、性别、遗传背景、饮食、药物和尿量等因素均影响晶体形成。尿调节素（Uromodulin, Umod），又称Tamm–Horsfall蛋白（THP），是一种主要由肾小管厚壁段（TAL）产生的糖蛋白，是生理条件下尿中最丰富的蛋白质。Umod通过调节钠-钾-氯协同转运蛋白2（NKCC2）和肾外髓钾通道（ROMK）活性参与电解质转运，并具有抗尿路感染、抑制肾结石形成和保护肾脏损伤的作用。Umod的前体在内质网中加工，经高尔基体修饰后，通过丝氨酸蛋白酶hepsin切割，以563个氨基酸的单体形式（分子量80–100 kDa）分泌到肾小管腔中。少量Umod被导向基底膜，进入体循环（分子量85–90 kDa）。生理条件下，尿Umod浓度为20–50 μg/mL，血浆浓度为20–50 ng/mL。Umod表达和功能的改变与多种肾脏疾病相关，包括晶体性肾病，其中Umod水平可能下调。尽管对Umod的生理作用已有广泛了解，但关于其在预防晶体诱导肾损伤中的治疗潜力的研究较少。本研究假设外源性Umod可能减轻晶体性肾病相关的损伤过程，调节促炎反应，并缓解肾损伤的某些方面。因此，本研究旨在探讨外源性Umod给药对晶体性肾病模型肾损伤的影响。

材料与方法

动物模型

使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，随机分为四组：对照组（注射生理盐水）、Umod组（注射外源性Umod）、NaOx组（注射钠草酸盐）和UNaOx组（联合注射Umod和NaOx）。NaOx剂量为9 mg/100 g体重，Umod剂量为5 μg/只动物。处理后，小鼠在代谢笼中饲养24小时后处死，收集血液、尿液和肾脏组织用于后续分析。

代谢参数

监测体重变化、食物和水摄入量、尿流量等代谢参数。

样本收集

通过心脏穿刺采集血液，取肾脏组织用于组织学、基因和蛋白表达分析。左肾冻存于-80°C，右肾用4%多聚甲醛固定。

肾功能评估

使用液相色谱-质谱法（LC-MS）测定血清肌酐，比色法测定尿肌酐，银染法测定尿白蛋白，蒸汽压渗透压计测量尿渗透压。

肾脏形态学

4 μm肾组织切片进行HE染色，观察组织形态，计数晶体和蛋白管型沉积。

基因表达分析

通过qPCR检测肾脏组织中Havcr1（Kim-1）、Lcn2（NGAL）、Mki67（Ki-67）以及炎症因子（Tnf、Il1b、Il6、Ccl2、Cxcl1、Cxcl10）和纤维化标志物（Acta2、Col1a1、Col4a1）的mRNA表达。

蛋白表达分析

通过免疫印迹检测Umod和β-actin蛋白表达，免疫荧光和免疫组化分析Umod、hepsin、Kim-1、NGAL和megalin的蛋白表达和定位。

细胞培养

使用小鼠TAL来源的ST-1细胞系，培养于DMEM培养基中，验证NKCC2和Umod表达后，用于体外实验。

实验设计

ST-1细胞分为对照组、CaOx组（200 μg/mL CaOx处理）和UCaOx组（CaOx加5 μg/mL Umod处理）。处理6或24小时后，通过流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V-FITC/7-AAD染色），免疫荧光分析Umod和caspase-8表达。

统计分析

使用Kruskal–Wallis检验进行多组比较，Mann–Whitney U检验进行两组比较。体外实验使用Brown–Forsythe和Welch ANOVA检验。P < 0.05认为有统计学意义。

结果

代谢和生理参数

NaOx处理显著降低食物摄入量，增加水摄入量，但不影响尿流量和体重增加。肾脏重量显著增加。Umod联合治疗减轻了这些变化，恢复食物摄入，降低水摄入，并使肾脏重量正常化。

外源性Umod减轻NaOx诱导的肾小管损伤、管型形成和晶体沉积

NaOx处理导致肾皮质和髓质区域晶体形成和蛋白管型沉积，伴随肾小管扩张和刷状缘丢失。NaOx组Havcr1、Lcn2和Mki67 mRNA表达显著上调。免疫组化显示Kim-1和NGAL蛋白在肾小管上皮细胞和管腔中显著增加。Umod联合治疗减轻了这些变化，降低了损伤标志物表达。

外源性Umod对肾小管转运和白蛋白排泄的影响

NaOx处理降低megalin表达，增加血清肌酐和尿白蛋白排泄，降低尿肌酐和尿渗透压。Umod联合治疗改善megalin表达（但无统计学意义），减少尿白蛋白排泄，恢复尿肌酐和尿渗透压至对照组水平。

外源性Umod减轻NaOx诱导的肾脏Umod蛋白表达模式和尿排泄变化

免疫荧光显示，对照组Umod和hepsin在TAL细胞中共定位较低。NaOx处理增加Umod/hepsin共定位，形成Umod阳性管型，表明Umod切割增加。Umod联合治疗减轻这些效应。免疫印迹显示肾脏Umod表达无显著变化，但尿Umod排泄在NaOx组减少（100 kDa条带），出现50 kDa条带（去糖基化Umod）。Umod联合治疗部分恢复尿Umod排泄。

CaOx敏感凋亡被外源性Umod体外减弱

CaOx处理24小时显著诱导ST-1细胞凋亡，降低Umod表达，增加caspase-8免疫染色和核周定位。Umod联合治疗减轻凋亡，恢复caspase-8表达和定位。

外源性Umod减轻NaOx诱导的促炎和促纤维化反应

NaOx处理显著上调炎症因子（Tnf、Il1b、Il6、Ccl2、Cxcl1、Cxcl10）和纤维化标志物（Acta2、Col1a1、Col4a1）的mRNA表达。Umod联合治疗减轻这些因子的上调，恢复至接近对照组水平。

讨论

晶体性肾病是一个复杂的多因素过程，由肾小管腔内溶质（如钠、钾、钙、镁、铵、磷酸盐、尿素和草酸盐）浓度增加驱动。草酸盐来源于饮食和内源性前体（如抗坏血酸和乙醛酸盐），在肾小球过滤后，通过近端小管上皮细胞的阴离子转运体SLC26A1（基底膜）和SLC26A6（管腔膜）分泌。在肾小管腔内，草酸盐与钙离子结合形成草酸钙（CaOx），可结晶并饱和尿液。Umod已被证明可减少晶体形成，并保护 against尿路感染。

本研究中，NaOx处理动物表现出强烈的晶体沉积和蛋白管型，而Umod联合治疗显著减轻这些效应，与Umod抑制CaOx晶体聚集的已知作用一致。Umod可能通过影响肾小管钠处理间接影响尿渗透压。Umod与TAL相互作用，调节NKCC2活性和钠重吸收，最终影响髓质渗透梯度和水重吸收。NaOx输注和晶体形成可能暂时降低尿渗透压，引起不适，导致水摄入增加和食物消耗减少——这些变化被Umod联合治疗纠正。

肾小管上皮细胞损伤后可发生凋亡，存活细胞通过去分化、迁移、增殖和再分化启动适应性修复。NaOx处理动物Havcr1（Kim-1）、Lcn2（NGAL）和Mki67（Ki-67）mRNA表达显著上调，免疫组化证实Kim-1和NGAL蛋白在肾脏中显著增加。Umod联合治疗减轻这些标志物表达，表明Umod可能支持上皮修复。

近端小管细胞损伤常 disrupts内吞作用。Megalin与cubilin复合物是近端小管中高表达的内吞受体，促进蛋白质（包括白蛋白）重吸收。NaOx诱导的急性肾损伤导致megalin表达减少，伴随血清肌酐增加和白蛋白尿。Umod联合治疗显著减少白蛋白尿，但不恢复肾小管megalin表达或影响血清肌酐，提示Umod可能调节肾小球超滤屏障。

Umod和hepsin的定位模式不同。hepsin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，对Umod切割、管腔释放和聚合至关重要。对照组Umod在TAL细胞内组织良好，hepsin主要位于相邻肾小管并与细胞核共定位。NaOx处理动物Umod表达 disorganized，形成Umod阳性管型和增加囊泡积累，导致肾脏总Umod蛋白表达轻微增加。hepsin与Umod在受损肾小管中共定位，但细胞核定位缺失。Umod联合治疗恢复肾小管组织，正常化总Umod蛋白水平，并重新建立细胞内hepsin标记，表明外源性Umod可能减轻病理条件下这些蛋白质之间的异常蛋白运输和应激诱导相互作用。

Umod是一种100 kDa糖蛋白，尿中含量丰富（20–50 μg/mL）。生理条件下，它聚合成大聚合物，形成疏水凝胶或透明管型。该凝胶通过结合大肠杆菌发挥抗菌作用，防止其粘附尿路上皮；因此，尿路感染更常见于Umod合成异常或减少的个体。本研究中，NaOx组透明管型丰富，伴随尿中100 kDa糖基化Umod条带减少，而50 kDa去糖基化Umod条带突出。Umod联合治疗减轻这些改变，可能反映其促进TAL上皮修复的作用。

为进一步研究CaOx诱导肾小管损伤的机制，用CaOx处理ST-1细胞24小时显著增加凋亡率，降低Umod表达，表明晶体诱导损伤不仅激活细胞死亡通路，还损害肾小管上皮水平该关键蛋白的生产。免疫染色显示CaOx处理细胞caspase-8标记强烈，信号在核周区域积累，而对照组细胞caspase-8弥漫分布于细胞质中。Umod联合治疗恢复caspase-8表达水平和亚细胞定位至接近对照模式。Caspase-8是一种多功能半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，以酶原形式合成，基础条件下主要位于线粒体中。凋亡刺激后，它被激活并易位至核周区域。重要的是，激活的caspase-8直接切割并激活caspase-3，是外源性凋亡通路的关键步骤。除细胞死亡作用外，caspase-8还可能独立于凋亡调节炎症反应。因此，线粒体对caspase-8的调节在CaOx诱导ST1细胞凋亡中至关重要。值得注意的是，Umod联合治疗与正常化caspase-8水平和定位相关，提示对凋亡信号的潜在调节作用。

Caspase-8还有非凋亡作用，包括调节坏死性凋亡和炎症细胞因子表达。本研究数据与此一致，NaOx诱导的急性肾损伤显著增加Tnf-α、Il1b、Il6、Ccl2和趋化因子（Cxcl1和Cxcl10）mRNA水平，表明细胞因子和趋化因子在炎症反应中均起关键作用。此外，NaOx处理动物显示Acta2（α-平滑肌 actin）、Col1a1（胶原I）和Col4a1（胶原IV）表达增加，指示早期纤维化。值得注意的是，Umod联合治疗减轻大多数促炎和促纤维化标志物，除Il1b外。本研究结果进一步支持外源性Umod在减轻NaOx诱导肾小管损伤相关肾 alterations中的潜在作用。

伦理批准

所有动物程序经圣保罗大学生物医学科学研究所动物护理和使用委员会（CEUA-ICB/USP, No. 3894050221）批准。

数据可用性

数据可根据合理要求提供。

致谢

感谢Tarek M. El-Achkar博士（印第安纳大学医学院）为血浆肌酐实验提供资金和智力支持。感谢El-Achkar实验室所有成员的宝贵意见。特别感谢Azuma Nanamatsu博士的 thoughtful指导和支持。

资助

本研究得到圣保罗研究基金会（FAPESP）资助（Grant Nos. 22/01288-7和2024/22770-7 to M.O.-S.），国家科学技术发展委员会（CNPq）资助（Grant No. 312055/2021-8 to M.O.-S.），和FAPESP资助（Grant No. 21/09277-1 to L.d.A.）。本研究还部分由CAPES-Brasil资助（Finance Code 001）。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

L.d.A.和M.O.-S.构思和设计研究；L.d.A.、N.P.-L.、B.C.S.P.和J.M.d.C.-P.进行实验；L.d.A.和M.O.-S.分析数据；L.d.A.、N.P.-L.和M.O.-S.解释实验结果；L.d.A.和M.O.-S.制备图表；L.d.A.和M.O.-S.起草稿件；所有作者编辑和修订稿件并批准最终版本。