膳食钾补充恢复钠缺乏肾小管特异性CAP1/Prss8缺陷小鼠正常醛固酮水平的作用与机制研究

本研究深入探讨了丝氨酸蛋白酶CAP1/Prss8（prostasin）在醛固酮合成调控中的关键作用。通过肾小管特异性基因敲除模型，发现低钠饮食下小鼠出现低醛固酮血症与低钾血症，而高钾饮食可完全逆转这一表型，恢复正常醛固酮水平与电解质平衡。研究揭示了肾脏与肾上腺器官间的新型交叉对话机制，为高血压与低醛固酮血症的治疗提供了新靶点与理论依据。

　　

INTRODUCTION

高血压是一种常见的慢性疾病，是中风、心血管和肾脏疾病以及过早死亡的主要原因。根据盖顿假说，肾脏在血压控制中扮演核心角色，而肾上皮钠通道（ENaC）在钠平衡的最终调节中具有关键作用。在多种调节ENaC活性的因素中，膜结合丝氨酸蛋白酶可能通过逐步蛋白水解激活ENaC，从而决定通道活性。腺病毒介导的人prostasin基因递送大鼠实验表明，当过表达丝氨酸蛋白酶CAP1/Prss8（通道激活蛋白酶1，prostasin）时，与醛固酮产生增加和高血压相关。

在人类中，丝氨酸蛋白酶prostasin被确定为高血压的可能候选基因。研究发现prostasin的遗传变异与儿童和青少年高血压的发展有关。Prostasin还被提出作为人类ENaC激活的尿液候选标志物。在原发性醛固酮增多症的高血压患者中，尿液prostasin排泄增加。人类尿液prostasin水平与尿液或血浆醛固酮水平强烈相关，甚至可能作为高血压患者ENaC激活的替代标志物。然而，该研究无法确定是内源性醛固酮调节prostasin表达还是相反。

在钠剥夺条件下，小鼠肾小管特异性CAP1/Prss8缺陷导致低醛固酮血症和低血钾，但ENaC激活没有变化。这强烈表明醛固酮生产与肾素-血管紧张素-醛固酮通路解耦。由于血浆钾增加直接刺激醛固酮分泌作为对抗高钾血症发展的保护机制，敲除小鼠同时接受低钠和高钾饮食挑战，以进一步损害肾脏液体调节。钾补充后，醛固酮合成和生产恢复，表明钾介导了肾脏CAP1/Prss8（prostasin）表达与肾上腺醛固酮生产之间的联系。

MATERIALS AND METHODS

通过交叉繁殖携带floxed CAP1/Prss8等位基因（Prss8^lox/lox）和转基因Pax8-rTA^tg/0或TRE-LC1^tg/0的小鼠，获得年龄匹配的雌性和雄性对照（Ctl, Prss8^lox/lox;Pax8-rTA^tg/0;TRE-LC1^0/0, Prss8^lox/lox;Pax8-rTA^0/0;TRE-LC1^tg/0, 和 Prss8^lox/lox）和敲除（Ko, Prss8^lox/lox;Pax8-rTA^tg/0;TRE-LC1^tg/0）小鼠。如先前所述，生成可诱导肾单位特异性CAP1/Prss8雄性和雌性敲除和对照小鼠。

使用Qiagen RNeasy Mini kit从冷冻肾脏样本中分离mRNA。使用Power SYBRgreen PCR Master Mix进行实时PCR，并在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR系统上运行。每次测量进行三次重复，并标准化到Gapdh。

使用TissueLyzer从冷冻组织中提取蛋白质，并通过SDS-PAGE在10%丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。使用以下一抗：Cyp11b1、Cyp11b2、pT53-NCC、pT58-NCC、NCC、αENaC、γENaC。使用β-actin或Gapdh表达控制蛋白质负载。

在标准饮食（SD, 0.17% Na⁺）后，小鼠在代谢笼中保持四天，接受低钠（0.01% Na⁺）和高钾（5%）饮食。测定以下生理参数：血浆Na⁺和K⁺浓度、Δ体重、24小时食物和水摄入、尿量、粪便输出、尿Na⁺和K⁺排泄、血浆醛固酮浓度、血浆和尿液肌酐、排泄率和分数排泄。

所有数据表示为散点图，使用GraphPad Prism进行所有统计分析。使用未配对双尾Welch t检验分析血浆醛固酮浓度以及蛋白质和基因表达。结果表示为平均值±标准误，P值<0.05被认为具有统计学显著性。

RESULTS

Upon K⁺ Supplementation, Hypoaldosteronism and Hypokalemia Are Corrected in Na⁺-Deprived Renal Tubule-Specific CAP1/Prss8 Knockout Mice

钾补充后，钠剥夺的CAP1/Prss8敲除小鼠表现出正常范围的血浆钠和钾浓度，不再与对照小鼠不同。体重、食物摄入、水摄入、尿量或粪便输出等生理参数在基因型之间没有差异。同样，钠和钾的分数排泄在两组中相似。血浆醛固酮水平增加但与对照小鼠相比没有改变。在低钠/高钾饮食下，CAP1/Prss8敲除小鼠显示出醛固酮依赖的钠和钾处理的正常化。

钠转运系统如噻嗪敏感性氯化钠协同转运蛋白NCC及其磷酸化形式T53和T58，以及α和γENaC的蛋白质丰度与低钠/高钾饮食下的对照同窝仔没有不同。全长αENaC蛋白质丰度与对照没有不同，尽管切割与全长αENaC亚基的比率在Ko小鼠中降低。雌性对照小鼠倾向于表现出比雄性对照更低的比率，而雄性Ko小鼠表现出比其雄性对照同窝仔更低的比率。总体而言，未检测到性别特异性差异，除了切割与全长αENaC亚基的比率，但由于每性别动物数量少，无法评估这些差异。

K⁺ Supplementation Restored Aldosterone-Synthase Protein Abundance and Synthesis in Renal CAP1/Prss8-Deficient Mice

为了进一步理解为什么在Ko小鼠低钠/高钾饮食下血浆醛固酮水平恢复，我们评估了肾上腺类固醇11β-羟化酶Cyp11b1和醛固酮合酶Cyp11b2的mRNA转录和蛋白质表达。我们的分析未揭示敲除组与对照组在mRNA转录表达水平上的差异。Prss8（prostasin）的转录表达仅在肾脏中检测到，在对照和Ko小鼠的肾上腺中缺失。

虽然Cyp11b1的蛋白质丰度在两种饮食条件下两组中相似，但Cyp11b1蛋白质表达仅在低钠饮食的Ko小鼠中显著降低。在低钠/高钾饮食下，Cyp11b2蛋白质丰度的差异不再可检测。总体而言，未检测到性别特异性差异。

DISCUSSION

本研究旨在确定在钠剥夺肾小管特异性敲除小鼠中观察到的低醛固酮血症的触发因素，其中醛固酮生产与肾素-血管紧张素-醛固酮通路解耦。在钠剥夺条件下，缺乏CAP1/Prss8（prostasin）的小鼠显示出显著较低的血浆醛固酮水平和改变的钾处理，这在钾补充后正常化，不再与对照小鼠不同。

文献中越来越多的证据表明醛固酮合成和/或生产可能是prostasin的靶标。在大鼠中，腺病毒介导的人prostasin基因的系统表达导致血浆prostasin和醛固酮水平增加，随后发生高血压。报道称用重组prostasin蛋白处理人类肾上腺皮质细胞系（H295R细胞）增加了醛固酮合成。在这种情况下，重组丝氨酸蛋白酶的直接蛋白水解效应被排除，因为用蛋白酶抑制剂camostat mesylate处理对醛固酮合成没有影响， rather表明prostasin与参与醛固酮生产的蛋白质的直接蛋白质-蛋白质相互作用。

在这些肾上腺细胞中表达重组prostasin进一步增加了转录CYP11B2启动子活性和mRNA转录表达。在钠剥夺肾小管特异性CAP1/Prss8 Ko小鼠中，减少的醛固酮生产与 diminished Cyp11b2蛋白质表达相关，我们现在证明这在额外的钾补充后正常化。有趣的是，在对照以及CAP1/Prss8 Ko小鼠中，未发现醛固酮合酶（Cyp11b2）在肾上腺中的转录表达。因此，我们 rather提出prostasin与醛固酮合酶的间接相互作用，可能包括一个尚未识别的蛋白质。

如在钠剥夺CAP1/Prss8 Ko小鼠中发现的低醛固酮血症，当与饮食因素如低钠和高钾结合时，可能导致显著的电解质失衡。在钾补充和低钠饮食下，因此我们预期我们的Ko小鼠进一步失衡如高钾血症和/或低钠血症。出乎意料的是，钠剥夺CAP1/Prss8敲除小鼠中的超生理钾补充恢复了醛固酮调节和正常化的钾处理（与对照处理小鼠没有不同）。

增加的钾水平通常刺激醛固酮，然后增加肾脏钾损失。由于醛固酮对于钾稳态以排泄过量钾负载和最大化钾尿至关重要，通过NCC失活限制钠保留。大鼠的4%膳食KCl补充导致快速钾尿、钠尿和利尿，与噻嗪敏感性氯化钠协同转运蛋白NCC磷酸化减少相关，以将钠向下游转移到ENaC吸收。在我们的研究中，蛋白质表达以及NCC的磷酸化与对照处理动物没有不同。

有趣的是，醛固酮合酶敲除（cyp11b2 Ko; AS^?/?）小鼠适应生理膳食钾摄入而没有高钾血症，这似乎由钠和钾转运的醛固酮非依赖性活动介导。肾小球细胞中的钾信号涉及去极化以允许细胞外钙通过T型和L型钙通道流入，N型钙通道，和钙调蛋白依赖性激酶I。在未来的研究中，分析这些参与者是否受到prostasin影响可能是值得的。

总体而言，CAP1/Prss8（prostasin）和/或进一步丝氨酸蛋白酶如何参与醛固酮合成调节的机制仍然未知。双重缺陷用于 both the丝氨酸蛋白酶CAP3/St14（matriptase）和CAP1/Prss8（prostasin）的小鼠在钠剥夺饮食上维持钠和钾平衡，并显示血浆醛固酮水平如对照处理动物，因此不同于先前观察到的单CAP1/Prss8 Ko小鼠的表型。这些数据清楚地表明这些蛋白酶蛋白质丰度相关，尽管它们似乎不是同一蛋白水解通路的一部分。

Prostasin和matriptase还被确定为蛋白酶激活受体2（PAR-2）的有效激活剂。然而，仅PAR-1在大鼠肾上腺中检测到，其表达通过膳食钠剥夺增加，并显示参与肾脏血流动力学和肾小管功能的调节，但也参与醛固酮分泌。肾小管特异性CAP1/Prss8 Ko小鼠可能因此进一步帮助剖析蛋白酶、激酶和受体之间的这种复杂相互作用。

Prostasin表达或活动的改变与高血压和液体平衡障碍相关。靶向prostasin因此可能是调节醛固酮生产的有希望的方法，尽管精确的分子机制需要进一步调查。理解肾脏丝氨酸蛋白酶CAP1/Prss8的缺陷如何影响肾上腺醛固酮合成可能提供有价值的见解 into these two organs的交叉对话 and into调节醛固酮合成和/或生产的通路。这种知识可能为低醛固酮血症和/或高血压的治疗开辟新途径。