SerpinE2缺乏通过血管生成失调和炎症反应加剧糖尿病肾病的肾小球损伤

本研究首次揭示丝氨酸蛋白酶抑制剂SerpinE2（PN-1）在糖尿病肾病（DN）中的保护作用。通过两种糖尿病模型（STZ诱导的1型和db/db 2型糖尿病），发现SerpinE2?/?小鼠表现出更严重的肾小球损伤（肥大、胶原IV积累、nephrin减少）、肾功能恶化（尿白蛋白/肌酐比值升高）及早期血管生成增加和炎症因子（IL-6、TNF-α、midkine）上调。SerpinE2通过调控早期血管生成和炎症过程限制DN进展，为治疗提供了新靶点。

　　

引言

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因。作为一种多因素疾病，DN涉及多种分子病理过程和组织结构改变，其中炎症和血管生成在疾病机制中扮演关键角色。糖尿病患者肾脏血管异常与异常血管生成相关，同时慢性炎症状态伴随细胞因子和生长因子分泌，与血管生成过程紧密交织。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）超家族多个成员被证明在炎症和组织修复中起调节作用，包括纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、megsin、色素上皮衍生因子（PEDF）和kallistatin等。SerpinE2（又称蛋白酶nexin-1, PN-1）是serpin家族成员，由血管细胞和炎症细胞表达，在血管损伤中作为关键调节因子崭露头角。既往研究表明，SerpinE2在血管生物学中发挥重要作用，特别是在血管生成调节方面，且与生长因子midkine表达相关。在肾脏中，SerpinE2在血管、间质和肾小球中均有表达，尤其在肾小球系膜细胞中检测到显著mRNA水平。DN患者和小鼠的肾小球和肾小管间质中均观察到SerpinE2过表达，提示其可能参与DN发展过程。

材料与方法

研究使用SerpinE2缺陷小鼠及其野生型（WT）同窝对照（C57BL/6背景），通过杂合子交配获得。1型糖尿病模型采用链脲佐菌素（STZ）诱导（8-12周龄雄性小鼠，65 mg/kg腹腔注射5次），2型糖尿病模型使用db/db小鼠（12月龄，雌雄均用）。动物实验遵循法国伦理法律和ARRIVE指南，获得法国高等教育、研究与创新部批准。分析指标包括体重、血糖、尿白蛋白/肌酐比值（ACR）、血浆肌酐和尿素氮水平。组织学分析采用Masson三色染色测量肾小球面积，免疫组化检测毛细血管密度（isolectin B4或CD31标记）、细胞增殖（Ki67）、胶原IV和nephrin表达。超声成像评估肾动脉血流速度。采用qRT-PCR分析炎症因子（IL-6、TNF-α）和midkine的mRNA表达，Western blot检测SerpinE2蛋白水平。X-Gal染色用于定位SerpinE2表达（SerpinE2/LacZ报告小鼠）。统计学分析采用GraphPad Prism软件，正态分布数据使用Student t检验，非正态数据使用Mann-Whitney U检验，多组比较采用ANOVA或Kruskal-Wallis检验。

结果

SerpinE2在糖尿病肾脏中表达增加

在两种糖尿病模型中，均观察到肾脏SerpinE2表达上调。在STZ诱导的1型糖尿病中，肾脏SerpinE2 mRNA水平增加3倍，晚期（16周）蛋白水平增加2.3倍。X-Gal染色显示糖尿病小鼠肾脏染色强度高于对照，16周后增加3.5倍，证实SerpinE2在1型糖尿病模型中过表达。在非糖尿病小鼠中，SerpinE2主要表达于肾小球和动脉；糖尿病肾脏中，SerpinE2表达在血管内显著升高并扩展至整个皮质。在2型糖尿病db/db模型中，SerpinE2 mRNA水平增加2.5倍，蛋白条带强度增加1.5倍。这些结果表明，SerpinE2在1型和2型糖尿病肾脏中均被诱导表达。

SerpinE2缺陷加剧糖尿病诱导的肾小球损伤

STZ诱导的1型糖尿病不影响小鼠体重，肾重/体重比和血糖在PN1^?/?和WT小鼠中相似。晚期STZ糖尿病中，WT和SerpinE2^?/?小鼠均出现肾小球肥大，但SerpinE2^?/?小鼠增加更显著。2型糖尿病中，仅SerpinE2^?/?小鼠出现肾小球肥大（雌雄均如此）。胶原IV免疫标记显示，1型糖尿病肾小球信号增加，但WT和KO小鼠间无显著差异；2型糖尿病中，SerpinE2^?/?小鼠胶原IV积累显著增加，表明基质积累增多。nephrin表达分析显示，1型糖尿病中RNA水平无显著差异，但SerpinE2^?/?小鼠肾小球nephrin标记减少（P=0.0949）；2型糖尿病中，nephrin RNA和蛋白水平在糖尿病肾小球中均显著降低，且SerpinE2^?/?小鼠降低更明显（RNA水平P=0.0024）。肾功能方面，1型糖尿病中，WT小鼠ACR无变化，而SerpinE2^?/?小鼠ACR增加2.5倍；血浆肌酐水平在STZ处理小鼠中增加，且SerpinE2^?/?小鼠显著高于WT。2型糖尿病中，WT小鼠ACR较高（为1型10倍），SerpinE2^?/?小鼠ACR进一步增加7倍。雌雄结果相似，合并分析增强统计效能而无性别偏倚。这些结果表明，SerpinE2缺失加重了1型和2型糖尿病的肾病特征。

SerpinE2缺陷小鼠早期糖尿病肾小球血管化增加

在STZ模型早期糖尿病中，肾小球血管生成增加。isolectin标记显示，糖尿病WT肾脏肾小球血管化有1.2倍增加趋势（不显著），而SerpinE2^?/?糖尿病小鼠肾小球血管密度较非糖尿病小鼠显著增加2倍。血管化增加伴随肾小球细胞增殖，SerpinE2^?/?肾小球增殖显著高于WT。血管生成增加与VEGF表达无关，因VEGF mRNA水平在WT和SerpinE2^?/? STZ糖尿病中均无变化。超声成像显示，糖尿病反应中WT和SerpinE2^?/?小鼠肾动脉血流均减少，但SerpinE2^?/?小鼠减少程度显著低于WT小鼠。表明SerpinE2缺陷小鼠肾病恶化与疾病早期肾血管化改变相关。

SerpinE2缺陷小鼠早期糖尿病肾脏炎症增加

STZ模型早期糖尿病中，IL-6和TNF-α mRNA表达水平增加。与肾损伤更严重一致，SerpinE2^?/?糖尿病小鼠肾脏IL-6和TNF-α水平高于WT小鼠，提示SerpinE2缺失加剧炎症反应。血浆IL-6和TNF-α水平均低于ELISA检测限（<15 pg/mL），表明炎症激活可能局限于肾脏而非全身反应。midkine（MK）mRNA表达在1型糖尿病WT小鼠肾脏中降低，但SerpinE2^?/?小鼠中不变，故其MK mRNA水平较高；2型糖尿病中，WT和SerpinE2^?/?糖尿病小鼠肾脏MK表达均降低，但SerpinE2^?/?小鼠仍显著高于WT。TNF-α和MK过表达可能参与SerpinE2缺陷小鼠DN发展恶化。

讨论

本研究首次在1型和2型糖尿病动物模型中探讨SerpinE2在DN中的表达和作用。结果表明，SerpinE2在两种糖尿病中均过表达，其缺失通过加重肾病组织学标志和损害肾功能（蛋白尿、血浆肌酐升高）而加剧DN。在C57BL/6背景WT小鼠中，STZ模型未出现蛋白尿，与此品系对肾损伤的抗性一致；但SerpinE2^?/?小鼠表现出早期肾病改变（肾小球面积和胶原含量增加），提示SerpinE2在1型糖尿病中起到对抗肾小球损伤的"保护盾"作用。与近期研究（Zheng等）中SerpinE2敲低减少系膜细胞系ECM积累的结果看似矛盾，可能因肾脏中SerpinE2表达不限于系膜细胞（本研究显示其在肾小球、肾血管和肾小管间质均过表达）。X-Gal染色证实表达超出肾小球，涉及更多细胞类型。DN动物模型中，新生血管形成与肾小球肥大相关，阻断血管生成可减轻糖尿病动物肾小球基底膜增厚和系膜扩张，提示这些血管在DN早期特征发展中起因果作用。本研究显示，生理状态下WT和SerpinE2缺陷小鼠肾脏血管化相似，表明SerpinE2以组织特异性方式调节生理性血管生成；但早期糖尿病中，SerpinE2^?/?小鼠血管生成程度更高（肾小球血管密度增加、细胞增殖增加），提示SerpinE2可能参与导致DN的早期事件。与某些研究不同，未观察到WT肾脏VEGF-A mRNA水平增加，可能与模型（小鼠而非大鼠）、样本（RNA而非蛋白）、组织（全肾而非仅肾小球）和/或分析时机有关；但结果与糖尿病WT小鼠肾小球血管密度无显著增加一致。SerpinE2^?/?肾小球中血管生成增加但VEGF水平与对照相似，符合既往体外结果（SerpinE2抗血管生成活性不依赖VEGF）。多普勒超声研究关联DN肾内血管阻力增加与血流减少，本研究观察到糖尿病反应中动脉血流减少，但SerpinE2^?/?小鼠减少较轻，与较高血管密度一致，提示SerpinE2缺陷可能改变肾脏血流动力学。单核/巨噬细胞内皮粘附和促炎细胞因子/趋化因子过表达 contribute to DN发病机制。本研究发现STZ模型早期糖尿病肾脏细胞因子mRNA水平增加，SerpinE2^?/?小鼠肾脏IL-6和TNF-α水平更高（血浆中不可测），表明炎症表型主要位于肾脏而非全身。MK水平在SerpinE2^?/?糖尿病小鼠肾脏中升高，其与DN肾小管间质炎症相关的关键作用已报道。TNF-α和MK过表达可能 contribute to SerpinE2缺陷小鼠DN发展恶化。研究局限性包括未直接测量肾小球滤过率（GFR），限制了对肾滤过能力的明确结论；尽管用蛋白尿变化作为肾功能指标，缺乏直接GFR评估（如FITC-菊粉清除率）是显著局限。未来研究应采用直接GFR测量技术强化生理学解释。但本研究首次明确显示，糖尿病小鼠SerpinE2缺失诱导加重性肾病组织学特征和蛋白尿增加。总体而言，工作为糖尿病肾病提供新见解，表明SerpinE2通过抑制炎症和血管生成，在1型和2型糖尿病中作为肾脏功能的正向调节因子。

数据可用性

数据可根据合理要求提供。

补充材料

补充图S1、S2和表S1可见DOI: 10.5281/zenodo.17098757。

资助

工作得到INSERM和巴黎西岱大学支持。J.Yu获中国奖学金理事会博士奖学金。

利益冲突

作者声明无财务或其他利益冲突。

作者贡献

L.I.和V.A.构思设计研究；L.I.、J.Y.、P.B.、B.R.、S.L.、Y.B.和V.A.进行实验；L.I.、J.Y.、P.B.、B.R.、S.L.、Y.B.和V.A.分析数据；L.I.、J.Y.、P.B.和V.A.解释实验结果；L.I.和V.A.制备图表；L.I.、J.Y.、P.B.、Y.B.、M.-C.B.和V.A.起草稿件；所有作者编辑修订并批准最终稿件。