膳食硝酸盐补充抑制绝经后女性静态握力运动中机械反射激活的交感神经反应

本研究发现，短期膳食硝酸盐补充（通过甜菜根汁，BRJ）可显著延长绝经后女性静态握力运动（SHG）的疲劳时间，并抑制运动初期（前30秒）肌肉交感神经活动（MSNA）的爆发频率（BF）和爆发发生率（BI），该效应与机械反射激活相关，且在早绝经女性中更为明显。研究提示，BRJ可能通过增强一氧化氮（NO）生物利用度，改善运动耐力，为绝经后女性运动不耐受提供了潜在的营养干预策略。

　　

引言

绝经后女性相较于同龄男性表现出更高的心血管疾病（CVD）和身体功能障碍风险。其机制可能与交感神经系统过度激活有关，衰老和雌激素缺失均会增加交感活性和交感介导的血管收缩。此外，绝经后女性在运动期间对压力反射的交感神经反应增强，导致收缩肌肉血流受限，这与易疲劳性相关，而疲劳是持续运动的障碍之一。

膳食硝酸盐补充是一种提高运动耐受性的辅助手段。研究表明，硝酸盐补充可改善健康年轻男性和女性的等长运动疲劳时间。值得注意的是，膳食硝酸盐补充还被发现可降低年轻个体运动期间的传出交感神经流出。交感神经（再）活动的减少可能与收缩肌肉血流量增加和引起疲劳的代谢物积累减少有关。然而，这些效应是否在老年人，尤其是绝经后女性中成立，尚属未知。绝经后女性可能因衰老和雌激素缺失而出现一氧化氮（NO）生物利用度的显著降低。NO缺乏可能与这些女性交感神经（再）活动增强和运动表现下降相关。

以往研究通过分离运动过程中的特定时间点来探究潜在机制。在运动高峰（代谢和交感活动达到最高水平）和运动后循环闭塞（PECO）期间（主要由代谢反射激活驱动）已被广泛研究以理解运动压力反应。近期研究表明，在亚最大握力运动开始时（即前30秒，主要激活机械反射），心血管反应增强，见于心血管疾病患者和创伤后应激障碍女性。相比之下，这些患者的代谢反射减弱或不变。因此，分别评估这些运动压力反射（即机械反射或代谢反射）至关重要，有助于确定膳食硝酸盐补充干预对绝经后女性的哪种反射影响更大。

基于此，本研究的主要目的是确定膳食硝酸盐补充对绝经后女性等长运动期间交感神经反应的影响。假设短期膳食硝酸盐补充会减弱绝经后女性等长握力期间机械反射和代谢反射激活的交感神经反应，并延长运动疲劳时间。此外，早绝经女性（即绝经年龄在40-44岁）比正常绝经女性（即绝经年龄在50-54岁）遭受更长期的雌激素缺乏和更高的心血管疾病风险。我们对参与者进行了早绝经和正常绝经的数据亚组分析。假设膳食硝酸盐补充对机械反射和代谢反射激活的交感神经反应的影响在早绝经女性中比正常绝经女性更大。

方法

伦理批准

研究获得德克萨斯大学西南医学中心和德州健康长老会医院达拉斯机构审查委员会的伦理批准（档案号：STU 032018-052），确保遵守《赫尔辛基宣言》原则。所有参与者在参与前提供书面知情同意。

参与者

从达拉斯-沃斯堡地区招募17名年龄≥60岁的健康绝经后女性。所有参与者均无确诊高血压、心肺和神经系统疾病、慢性肾脏病、糖尿病、当前酗酒或吸毒以及使用烟草产品。所有参与者均报告自然绝经，无人为手术或药物诱导绝经。过去10年内无激素替代治疗史。两名参与者因抑郁症服用选择性血清素再摄取抑制剂（氟西汀和维拉佐酮），可能影响自主神经系统功能。要求她们在测试日停用这些药物。17名参与者中，10人完成了膳食硝酸盐补充和安慰剂干预。两名参与者退出研究，四人仅完成硝酸盐干预，一人因COVID-19大流行限制仅完成安慰剂干预。

研究设计与实验方案

这是一项随机、安慰剂对照、双盲、交叉研究。要求参与者服用14天甜菜根汁（BRJ；140毫升，含~800毫克硝酸盐/天）或安慰剂（140毫升硝酸盐耗尽BRJ，每日），洗脱期超过14天。要求参与者在研究期间避免食用任何含甜菜根的食品或饮料。在每个干预期前后，参与者执行所述实验方案。

参与者在测试前至少2小时进食少量餐食，并禁食咖啡因、酒精和任何运动24小时。最后一次硝酸盐补充（或安慰剂）在测试前1-2小时服用。所有实验在上午9:00至下午3:00左右进行。实验在环境受控、环境温度约25°C的安静实验室中进行。仰卧休息至少20分钟后，采集血样，随后测量静息血压（BP）和心率（HR）。参与者用优势手使用握力计进行三次最大自愿收缩（MVC）。最高值用于测试。获得满意的肌肉交感神经活动（MSNA）信号后，在自主呼吸期间收集6分钟静息数据。1分钟基线后，以40% MVC进行静态握力（SHG）直至疲劳（达到最大努力）。实时握力通过参与者上方的屏幕监测；一旦施加的力低于目标力80%超过2秒，置于上臂的袖带立即充气至250 mmHg以引发PECO（分离肌肉代谢反射激活）。在SHG和PECO期间，告知参与者避免憋气。持续记录HR、逐搏BP、呼吸波形和MSNA。

测量

血流动力学

通过心电图（ECG，导联II）监测HR，通过手指光电体积描记法（Nexfin BMEYE，阿姆斯特丹，荷兰）测量逐搏BP，并通过自动血压计（SunTech Medical Instruments，Morrisville）验证。静息时心输出量（CO）采用乙炔再呼吸技术测量。这些数据用于校准SHG和PECO期间CO的动态变化，通过脉搏轮廓法从BP波形推导。总外周阻力（TPR）计算为平均BP（MBP）与CO的商。

MSNA

通过在腓神经处放置钨电极记录MSNA信号，参考电极置于记录电极皮下2-3厘米处。神经信号放大（70,000至160,000倍），带通滤波（700-2,000 Hz），全波整流，并通过电阻-电容电路（时间常数0.1秒）积分。可接受MSNA信号的标准包括脉冲同步、Valsalva动作低血压相期间 facilitation 和释放后高血压 overshoot 相抑制，以及对大声噪音不敏感。

血浆硝酸盐和亚硝酸盐水平

从肘静脉放置的静脉导管抽取血样，并用亚硝酸盐保存溶液收集于无亚硝酸盐管中。生物体液中NO代谢物（硝酸盐和亚硝酸盐：NO_x）的测量反映NO生物利用度。采用ELISA试剂盒（R&D Systems，货号KGE001）测量血浆样品中的NO代谢物。该测定基于硝酸盐还原酶将硝酸盐酶转化为亚硝酸盐，随后通过Griess反应比色检测亚硝酸盐。Griess反应基于两步重氮化反应，其中酸化的NO₂^-产生亚硝化剂，与磺胺酸反应产生重氮离子，该离子与N-(1-萘基)乙二胺偶联形成有色偶氮衍生物，在540-570 nm吸光。

数据分析

数据以625 Hz采样，使用商业数据采集系统（Biopac Systems，Santa Barbara, CA），并通过LabChart（ADInstruments Inc., Colorado）分析。逐搏HR根据ECG的R-R间期计算。逐搏收缩压（SBP）和舒张压（DBP）从动脉波形检测，并通过自动血压计（型号4240；SunTech Medical Instruments, Raleigh, NC）校准。根据既往发表的方法，从平均电压神经图轨迹识别MSNA爆发。爆发频率（BF）计算为每分钟爆发次数，爆发发生率（BI）计算为每100次心跳的爆发次数。MSNA总活动（TA）定义为爆发幅度乘以BF。基线期间最大爆发幅度赋值为100；因此，测试会话中的所有其他爆发在计算TA前均归一化至该爆发。所有爆发分析由经验人员确认。

值以均值±标准差（SD）表示。SHG前的基线平均1分钟。为对齐参与者时间点，分析30秒间隔平均值，匹配最短SHG持续时间（即最多90秒）。SHG结束期定义为每个个体SHG表现时间的最后30秒。PECO期间，平均最后30秒数据。变化（Δ）相对于每个个体SHG前的基线计算。这些值转换为每分钟单位。

统计分析

基于既往研究调查急性BRJ补充对年轻个体交感活动的影响，表明干预后MSNA变化的效应大小Cohen’s d = 1.3，计算每干预（BRJ或安慰剂）需要10名参与者样本量以达到80%检验效能，显著性水平0.05。

采用双因素[饮料（BRJ vs. 安慰剂）×阶段（前 vs. 后）]重复测量方差分析（ANOVA）用于基线值以及SHG和PECO期间的反应。采用三因素（饮料×阶段×时间）重复测量ANOVA用于SHG和PECO期间的反应。执行重复测量相关以评估 within‐subject 关联并估计共同回归斜率。采用Y-minimized回归分析确定回归方程。在早绝经与正常绝经数据亚组分析中，采用双因素[组（早 vs. 正常绝经）×阶段（前 vs. 后）]混合ANOVA用于基线值以及SHG和PECO期间的反应。确认显著差异后，采用Bonferroni检验作为事后检验检查各种 pairwise 比较中的任何显著差异。所有统计分析使用SPSS（v. 20, SPSS Inc., Chicago, IL）、GraphPad Prism（v. 10, GraphPad Software, Florida, MA）或R v. 4.3.3（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）与R Commander图形用户界面v. 2.9-5进行。统计显著性设定为P < 0.05。

结果

膳食硝酸盐补充对绝经后女性的影响

10名参与者的平均年龄为64 ± 2岁，身高166 ± 8厘米。两次干预后体重（安慰剂：71 ± 16 前 vs. 71 ± 16 千克后；BRJ：71 ± 16 前 vs. 71 ± 16 千克后；P = 0.92）或体重指数（安慰剂：25 ± 2 前 vs. 26 ± 3 千克/米²后；BRJ：26 ± 4 前 vs. 26 ± 4 千克/米²后；P = 0.89）无显著变化。

表1显示BRJ和安慰剂干预前SHG的基线变量。BRJ干预后，NO_x显著高于安慰剂干预后（P < 0.01）。两次干预后疲劳时间均增加（P = 0.04），但BRJ的增加大于安慰剂（Δ79 ± 67 vs. Δ9 ± 74秒，P = 0.03）。

在线补充图S1显示时间对齐的MSNA在基线和SHG及PECO期间，BRJ或安慰剂干预前后。MSNA反应无显著三因素（饮料×阶段×时间）交互作用（范围：P = 0.44–0.62）。补充表S1显示SHG和PECO期间的血流动力学反应。血流动力学反应也无显著三因素（饮料×阶段×时间）交互作用（范围：P = 0.24–0.54）。

我们分别评估了BRJ或安慰剂对机械和代谢反射激活的影响。图1说明从基线到SHG前30秒（0–30秒，左）和最后30秒（中）以及PECO最后30秒（右）的MSNA反应变化（Δ），在BRJ和安慰剂干预中。在左图中，BRJ显著降低SHG前30秒的ΔBF和ΔBI（P = 0.02和0.04），但安慰剂无（范围：P = 0.24–0.34）。相反，干预间ΔTA无显著差异（P = 0.39）。在中图和右图中，SHG结束和PECO时MSNA反应在两次干预间无显著差异（范围P = 0.57–0.99）。

表2显示SHG和PECO结束期间BRJ和安慰剂干预间的血流动力学反应。在SHG前30秒和最后30秒以及PECO结束时，SBP、DBP、MBP、HR、CO和TPR反应在两次干预间无显著差异（范围P = 0.06–0.95）。两次干预均增加SHG结束时的SBP、DBP、MBP和TPR（所有P < 0.01）以及PECO结束时的TPR（P = 0.05）。

图2显示两次干预后SHG前30秒MSNA反应变化（后-前）与SHG期间疲劳时间变化（后-前）的关系。重复测量相关揭示 within‐subject 关联 between changes in BF (r = ?0.65, P = 0.03), TA (r = ?0.62, P = 0.04), and BI (r = ?0.68, P = 0.02) and changes in the time to fatigue, respectively. 共同回归斜率（固定效应）在BF中为β = ?5.6 (P = 0.03)，在TA中为β = ?0.07 (P = 0.04)，在BI中为β = ?3.2 (P = 0.04)，表明分别与疲劳时间显著相关。

此外，当合并两次干预数据时，ΔBF和ΔBI与SHG前30秒的ΔTPR正相关（r = 0.13, P = 0.02 和 r = 0.35, P < 0.01）。

早绝经与正常绝经女性的比较

我们随后添加了四名额外参与者（3名早绝经和1名正常绝经）的数据，她们至少完成了BRJ干预。所有参与者根据绝经年龄分为两组（n = 6 早绝经，n = 8 正常绝经）。组间年龄（早 vs. 正常绝经：64 ± 2 vs. 64 ± 2岁，P = 0.54）、身高（166 ± 8 vs. 165 ± 8厘米，P = 0.54）和体重（66 ± 10 vs. 73 ± 16千克，P = 0.39）无显著差异。然而，早绝经组的绝经年龄显著年轻于正常绝经组（43 ± 1 vs. 53 ± 2岁，P < 0.01）。

表3显示早和正常绝经组BRJ干预前的身体特征和基线变量。组间所有变量无显著差异（范围：P = 0.27–0.99）。BRJ后组间NO_x无显著差异（P = 0.81）。

BRJ干预后，早和正常绝经组间SHG疲劳时间无显著差异（P = 0.57）。图3显示BRJ干预后组间从基线到SHG（左：前30秒和中：最后30秒）以及PECO最后30秒（右）的MSNA反应。在SHG前30秒（左），早绝经组的ΔBF和ΔBI在服用BRJ后显示显著下降（均P < 0.01），但ΔTA无（P = 0.36）。SHG结束（中）和PECO（右）时MSNA反应组间无显著差异（范围P = 0.11–0.69）。

图4显示BRJ干预后早和正常绝经组中绝经后年限与SHG前30秒MSNA变化的关系。每组一名参与者绝经年龄未知；因此，数据以早绝经n = 5和正常绝经n = 7绘制。绝经后年限与MSNA BF变化呈显著负相关（r = ?0.59, P = 0.04），而MSNA TA（r = ?0.27, P = 0.39）和BI（r = ?0.51, P = 0.09）无显著相关。

表4显示BRJ干预前后组间SHG和PECO结束期间的血流动力学反应。早绝经组在BRJ干预后SHG前30秒TPR下降（P = 0.05）。SHG结束和PECO时所有变量组间无显著差异（范围：P = 0.09–0.94）。

讨论

本研究发现，2周膳食硝酸盐补充与BRJ显著延长SHG期间的疲劳时间，并降低SHG开始时MSNA BF和BI反应，与安慰剂相比。这些结果主要在早绝经女性中比正常绝经女性更明显，似乎与绝经持续时间更长相关。此外，SHG前30秒MSNA反应变化与疲劳时间变化负相关。总之，这些结果表明膳食硝酸盐补充可能主要抑制机械反射激活而非代谢反射激活的交感神经反应，并改善绝经后女性的运动表现，尤其是那些早绝经女性（即雌激素和NO缺乏持续时间更长）。

硝酸盐补充对运动交感神经反应的影响

我们发现BRJ对参与者静息时MSNA和BP无显著影响。既往在老年人（≥60岁）中的短期（≤2周）干预研究也显示BRJ对静息BP无影响。相反，其他调查报道老年人静息BP降低。年轻参与者研究报道急性BRJ补充（~3小时）后静息MSNA降低，但BP不变。这些发现差异的一个原因可能是参与者身体特征差异。据报道，无机硝酸盐补充后血浆硝酸盐和亚硝酸盐水平在年轻人中高于老年人。衰老可能损害硝酸盐-亚硝酸盐-NO通路，导致BRJ对老年人BP和心血管功能的影响小于年轻人。此外，一项荟萃分析表明，BRJ对老年人BP的影响在基线BP较高者中更大。在当前研究中，所有参与者血压正常；因此，BRJ对静息MSNA和BP无深远影响。

运动交感神经反应由活跃骨骼肌中机械敏感（III组）和代谢敏感（IV组）传入神经末梢的信号投射触发。已证明III组传入神经的变形主要驱动运动开始时的交感神经反应变化，肌肉收缩停止后迅速下降。在SHG高峰和PECO期间，化学敏感IV组传入神经由于肌肉内代谢物积累和灌注不匹配继续传输信号，维持运动期间部分交感激活。相反，中枢命令已显示主要影响运动期间HR变化，并对持续等长运动期间不活跃肌肉的交感流出影响可忽略。当前研究数据可能表明BRJ干预主要抑制SHG开始时机械反射激活的MSNA反应。

BRJ干预后机械反射激活期间MSNA抑制的机制未知，但NO诱导的中枢交感抑制可能 contribute。研究证明NO在减弱运动压力反应中的作用，尤其是在机械反射激活期间。例如，在压力感受器去神经猫中，使用L-精氨酸输注提高孤束核（NTS）内NO产生，发现减少静态后肢收缩 evoked 的压力反应。相反，在高血压大鼠中，使用L-NAME抑制NTS内内源性NO产生，增强了对机械反射激活（即被动肌腱拉伸）的压力反应。确实，膳食硝酸盐补充已显示增加人类脑血流，表明口服补充的NO可跨血脑屏障并在中枢神经系统作用。在绝经后女性中，雌激素缺失导致中枢和外周NO生物利用度降低，可能与交感（再）活动增加相关。因此，在当前研究中，BRJ增加NO生物利用度，随后抑制绝经后女性等长运动期间的MSNA反应。

SHG期间疲劳时间在BRJ后延长，与SHG前30秒MSNA反应负相关。此外，MSNA BF和BI反应与SHG前30秒TPR反应正相关。持续等长压缩期间收缩骨骼肌的血流部分由运动压力反射控制，包括机械反射。绝经后女性表现出比绝经前女性增强的机械反射激活交感神经反应，导致收缩肌肉血流减少。后者与运动易疲劳性增加相关。我们近期发现老年女性在动态握力运动期间交感流出与血管导纳呈反比关系。这些结果表明MSNA抑制可能诱导血管扩张并增加收缩肌肉血流。总之，BRJ抑制SHG开始时的MSNA反应可能降低外周血管阻力并增加血流，为收缩肌肉提供更多氧气供应。所有这些可能 contribute 了SHG时间的延长。

干预间在SHG和PECO结束时的MSNA和BP反应无显著差异。据我们所知，尚无研究证明NO在调节代谢反射激活交感神经反应的中枢通路中起重要作用，与机械反射相反。此外，在外周，既往研究表明NO在肌肉代谢反射激活期间观察到的小外周血管扩张中作用很小。这些结果暗示代谢反射可能受NO变化影响小于机械反射。Schneider等人发现4周硝酸盐补充减弱PECO期间BP反应，但不在2分钟30% MVC SHG期间。这一发现可能表明代谢反射隔离期间交感活动可能减少；然而，机制未知。Schneider等人研究与我们发现差异的一个可能解释可能是参与者特征和SHG强度差异。这些因素可能导致代谢物产生水平不同。需要进一步研究理解潜在机制。

早绝经与正常绝经女性的差异

我们发现BRJ干预后SHG前30秒MSNA BF和BI反应在早绝经组比正常绝经组更 suppressed。这种抑制似乎与绝经持续时间更长相关。此外，早绝经组在BRJ后TPR反应显著下降。据我们所知，这是首次比较BRJ对早绝经与正常绝经老年女性运动MSNA反应影响的研究。BRJ在早绝经女性中对机械反射MSNA反应产生更显著影响的精确机制有待阐明。已表明较早绝经女性比正常绝经女性有更高心血管疾病风险。早绝经女性心血管风险升高部分归因于交感兴奋，可能与雌激素和NO缺乏持续时间更长相关，尽管基线交感活动和血流动力学参数与正常绝经女性相当。需要未来研究澄清绝经持续时间、NO可用性和老年女性心血管风险之间的关系。

实验考虑

本研究至少六个考虑。第一，未直接评估SHG期间MSNA与收缩肌肉血流的关系。这是由于在持续血管压缩期间活跃小肌肉评估这些变量的方法学困难。确实，既往研究仅能评估至下肢持续背屈期间 conduit 动脉水平，下肢大于上肢。第二，未测量SHG期间和后血液和肌肉组织中的代谢物。因此，无法评估BRJ后SHG和PECO期间代谢物变化，这些变化改变代谢反射和疲劳水平。第三，BRJ和安慰剂干预均增加SHG结束时的BP和TPR反应。这一观察的一个可能解释可能是SHG期间的疲劳时间。两次干预均增加SHG时间。如果比较相似SHG时间的前后数据，BP和TPR反应差异消失。第四，未评估参与者膳食NO消耗；尽管如此，至少所有参与者被要求避免甜菜根产品 during the study。第五，绝经年龄自我报告，无法独立验证。可能存在回忆偏倚。第六，在我们的方案中，干预后测量在最后一次硝酸盐剂量后1-2小时进行，对应最大血浆亚硝酸盐窗口。我们承认这种重叠可能导致BRJ对结果指标的急性影响，难以与2周累积效应区分。然而，14天每日硝酸盐补充也可能升高器官组织硝酸盐/亚硝酸盐池，并提高基线循环亚硝酸盐 beyond a single‐dose response，这可能 contribute 心血管益处。

结论

短期膳食硝酸盐补充可能主要减弱绝经后女性等长运动期间机械反射而非代谢反射激活的交感神经反应，这种减弱可能与延长运动表现时间相关。此外，初步工作表明硝酸盐补充对交感神经反应的影响在早绝经女性中大于正常绝经女性。然而，这些初步结果需要在更大队列中确认。