人呼吸道CFTR非依赖性前列腺素E2刺激的氯离子分泌机制研究

本研究揭示了前列腺素E2（PGE2）通过EP4受体介导的Src/PI3K/SGK1信号通路激活顶端CRAC通道、P2X受体和基底侧TRPV通道，从而驱动钙激活氯离子分泌（CaCC）的分子机制，为CFTR功能缺陷的肺部疾病提供了新的治疗靶点。

　　

引言

肺部作为持续暴露于潜在病原体的器官，拥有协调的细胞保护屏障（如黏液）、非病理性炎症反应以及先天性和适应性免疫保护机制来预防慢性感染。在健康状态下，支气管气管黏膜纤毛清除是清除黏液捕获微生物的关键，但在许多呼吸系统疾病中受损，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、原发性纤毛运动障碍、囊性纤维化（CF）和非CF相关支气管扩张。使用离体模型，上皮阴离子（Cl^?和HCO₃^?）分泌被确定为黏膜纤毛清除的关键驱动因素，其中囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）介导的Cl^?分泌占主要作用，这至少部分解释了遗传性和获得性CFTR功能丧失（如CF和COPD）如何导致反复肺部感染、损伤和潜在肺衰竭。

肺部加重促进前列腺素E₂（PGE₂）的释放，其在感染气道中含量丰富。PGE₂刺激气道跨上皮Cl^?和碳酸氢盐分泌以及黏膜纤毛清除，其中大部分但非全部依赖于CFTR。先前研究发现，PGE₂刺激的Cl^?分泌在支气管上皮细胞中完全依赖CFTR，但在整个气管或Calu-3黏膜下腺细胞中仅部分依赖CFTR；其余电流由钙激活氯通道（CaCCs）介导。在四种PGE₂受体（EP1–EP4）中，EP1和EP3通常涉及Ca²⁺信号，而EP2和EP4通常使用环磷酸腺苷（cAMP）信号。EP4还刺激磷酸肌醇3-激酶（PI3K）。目前尚不清楚PGE₂如何刺激黏膜下腺细胞中的CFTR非依赖性Cl^?电流或其发生机制。利用黏膜下腺中的这一机制可能为改善受CFTR和非CFTR相关肺部疾病影响的人群的气道Cl^?分泌和黏膜纤毛清除提供手段。

材料与方法

使用Calu-3细胞系（购自ATCC）和原代人支气管上皮（HBE）细胞（来自斯坦福大学和北卡罗来纳大学），按照已发表协议培养。细胞在气液界面（ALI）培养基中培养，当跨上皮电阻（由EVOM2测量）表明存在完整单层时使用（Calu-3细胞≥300 Ω·cm²，HBE细胞≥1,000 Ω·cm²）。小肠十二指肠类器官（肠样）根据标准协议培养，来自人十二指肠活检。使用尤斯室测量短路电流（I_sc），并通过qPCR和Fura-Red成像分别测定mRNA表达和细胞内Ca²⁺（Ca²⁺_i）。使用各种化学刺激剂和抑制剂，包括PGE₂、iloprost、butaprost、CAY-10598、CFTR_inh-172等。

结果

钙依赖性在Calu-3和HBE细胞中对PGE₂刺激的Cl^?分泌的作用

基于先前结果，即Calu-3而非HBE细胞具有CFTR_inh-172非依赖性、PGE₂刺激的CaCC电流，研究检查了Calu-3细胞在PGE₂刺激下是否比HBE细胞更依赖Ca²⁺信号。在Calu-3和HBE细胞中，双侧和仅基底侧去除细胞外Ca²⁺（Ca²⁺_e）减少了PGE₂刺激的I_sc，但蛋白激酶A（PKA）、肌醇1,4,5-三磷酸（IP₃）或Ca²⁺_i储存的抑制没有影响。十二指肠肠样使用了PKA、IP₃、Ca²⁺_i和Ca²⁺_e。在Calu-3和HBE细胞中，完全去除Ca²⁺_e几乎完全 abolished PGE₂刺激的I_sc（Calu-3: 87.2±3.0%; HBE: 90.4±1.8%）。仅去除基底侧Ca²⁺继续显著抑制PGE₂刺激的I_sc（Calu-3: 44.9±6.5%; HBE: 77.9±5.4%）。十二指肠肠样中的PGE₂刺激I_sc需要Ca²⁺_e、Ca²⁺_i储存和PKA。因此，PGE₂在Calu-3和HBE气道细胞中依赖Ca²⁺_e信号，但在十二指肠肠样中，PGE₂刺激更多样化的PKA和Ca²⁺信号。

Calu-3细胞、HBE细胞和十二指肠肠样中的EP受体表达和功能

在Calu-3细胞中，PGE₂受体mRNA谱为：PTGER4 > PTGER2 > PTGER3。未检测到PTGER1 mRNA。功能实验显示，iloprost和sulprostone引起的I_sc增加显著小于PGE₂，而butaprost和CAY-10598引起的增加与PGE₂相似。CFTR_inh-172抑制了iloprost、butaprost和sulprostone刺激反应的绝大部分（82.0-88.1%），而PGE₂和CAY-10598刺激的I_sc分别被抑制了61.0%和72.0%。在HBE细胞中，PTGER mRNA谱为：PTGER2 = PTGER4 > PTGER1 = PTGER3。功能实验显示，在1 μM时，iloprost、butaprost和sulprostone刺激的I_sc增加均显著小于PGE₂，而CAY-10598与PGE₂相似。在10 μM时，仅sulprostone显著小于PGE₂或CAY-10598。在HBE细胞中，PGE₂和所有EP1-EP4受体激动剂刺激的I_sc增加几乎完全被CFTR_inh-172抑制（83.9-98.8%）。在人十二指肠肠样中，PTGER mRNA谱为：PTGER4 > PTGER2 > PTGER1 > PTGER3。butaprost和CAY-10598（1和10 μM）刺激的I_sc增加幅度与PGE₂相似。与Calu-3或HBE细胞相反，iloprost与PGE₂刺激的I_sc增加没有差异。sulprostone刺激的I_sc在1 μM时显著小于PGE₂、butaprost和CAY-10598，但在10 μM时没有差异。肠样中CFTR依赖性的检查显示，除sulprostone外，所有其他EP受体激动剂显示相似的CFTR_inh-172抑制程度（72.7-83.5%）。总之，在气道和十二指肠上皮细胞中，EP2和EP4是主要的EP受体亚型，尽管十二指肠可能使用更广泛的EP受体。然而，基于这些药理学数据，EP受体亚型表达似乎不是决定PGE₂能否刺激气道或肠道中CFTR非依赖性Cl^?分泌的决定因素。

Calu-3细胞中EP4刺激的CFTR非依赖性Cl^?分泌的细胞内信号

基于EP4受体主要负责Calu-3细胞中PGE₂刺激的Cl^?分泌的CFTR非依赖性部分的数据，研究检查了其发生的细胞内信号机制。EP4受体已知使用PKA和PI3K细胞内信号通路。因此，研究检查了这些通路在EP4介导的CFTR非依赖性Cl^?分泌中的参与程度。在存在amiloride（10 μM，顶端）和CFTR_inh-172（20 μM，顶端）的情况下，H-89预处理（10 μM，双侧，30分钟）未能显著抑制CAY-10598刺激的I_sc（10 μM，基底侧）（13.0±7.1%）。Wortmannin（0.1 μM，基底侧，30分钟预处理），一种PI3K抑制剂，显著抑制了CAY-10598刺激的I_sc（32.6±8.0%），抑制Src（PI3K的上游激活剂）与dasatinib（10 μM，基底侧，30分钟预处理）有类似效果（30.0±10.8%），或抑制血清/糖皮质激素调节激酶1（SGK1）（PI3K的下游效应器）与GSK650394（10 μM，基底侧，30分钟预处理）（41.6±6.0%）。

由于PGE₂刺激的I_sc涉及Ca²⁺_e，研究检查了Ca²⁺信号在通过EP4受体刺激的CFTR非依赖性I_sc中的参与程度。CaCC抑制剂niflumic acid（100 μM，顶端）抑制了54.5±11.1%的CFTR_inh-172不敏感CAY-10598刺激的I_sc，残余I_sc被Na⁺:K⁺/2Cl^?（NKCC）转运体阻断剂bumetanide（20 μM，基底侧）抑制（100±0%）。GSK650394减少但未消除niflumic acid敏感的I_sc（28.7±2.4 vs. 40.5±5.5 ΔμA/cm²）。进行Ca²⁺_i成像和尤斯室实验以确定Ca²⁺内流的潜在来源。由于CFTR_inh-172的光学干扰，Ca²⁺_i成像使用glibenclamide进行，一种较不特异但常用的CFTR抑制剂。在存在glibenclamide（300 μM）的CFTR抑制下，CAY-10598引起显著的Ca²⁺_i增加，是瞬时的。接下来，研究检查了抑制PI3K、钙释放激活钙通道（CRACs）、P2X受体和TRPV通道与wortmannin（0.1 μM）或GSK650394（10 μM）、YM58483（10 μM）、PPADS（10 μM）和ruthenium red（10 μM） respectively，在CAY-10598（1 μM）刺激之前的效果。观察到PPADS和ruthenium red降低了峰值Ca²⁺_i，而所有研究的药物延迟了Ca²⁺瞬变，表明CRAC、P2X和TRPV参与介导EP4受体激活触发的Ca²⁺内流。为了确认这些结果并确定通过这些通道的Ca²⁺内流是否通过顶端或基底侧膜发生，进行了I_sc实验，从基底侧或顶端去除Ca²⁺。Wortmannin抑制I_sc， independent of which side it was added to。 Ruthenium red仅当应用于基底侧时抑制I_sc，而YM58483和PPADS仅当应用于顶端时显著抑制I_sc。总之，CFTR非依赖性EP4刺激的Cl^?电流涉及Src、PI3K和SGK1介导的细胞内信号以及通过CRAC和P2X通道的顶端Ca²⁺进入和通过瞬时受体电位香草素（TRPV）通道的基底侧Ca²⁺进入。

讨论

功能障碍的黏膜纤毛清除、感染、炎症和不可逆组织损伤的恶性循环可能导致肺功能下降和最终衰竭。黏膜纤毛清除由协调的气道Cl^?分泌（与水转运）和纤毛搏动频率驱动。CFTR在小和大气道中的离子细胞和分泌细胞中表达，以及大气道的黏膜下腺中。通过CFTR调节剂增加功能性CFTR功能通常导致肺功能显著改善和肺部加重减少。然而，有相当数量的个体无法使用CFTR调节剂治疗（由于不符合条件的CFTR变异或居住国未批准），由于不良反应无法维持治疗，或尽管调节剂治疗仍患有晚期肺病。尽管一部分COPD患者可能受益于CFTR调节剂，但这些患者也可能受益于CFTR非依赖性手段来改善黏膜纤毛清除。

先前研究发现，PGE₂刺激HBE细胞中的CFTR依赖性Cl^?分泌，但也能在雪貂气管（包含黏膜下腺）和Calu-3细胞（黏膜下腺浆液细胞的细胞系模型）中引起CFTR非依赖性Cl^?分泌。最初假设Calu-3和HBE细胞之间的区别在于PGE₂受体利用的差异，可能使用Ca²⁺依赖性EP受体（如EP1或EP3），鉴于CaCC介导CFTR非依赖性Cl^?分泌的参与。然而，令人惊讶的是，发现Calu-3和HBE细胞具有相似的EP mRNA受体表达模式、EP受体功能和PGE₂刺激Cl^?分泌的Ca²⁺依赖性，但仅Calu-3细胞显示CFTR非依赖性分泌反应。此外，由于十二指肠能够对PGE₂产生CFTR非依赖性阴离子分泌，预期十二指肠可能具有与Calu-3细胞更相似的EP受体和信号谱。这也未成立。Calu-3和HBE细胞在功能上彼此更相似，而不是与十二指肠上皮细胞相似。未进行同时抑制多种EP受体亚型的实验；因此，不能排除PGE₂刺激氯离子分泌中潜在EP受体串扰或异二聚化参与。此外，未来使用瞬时或慢性敲低/敲除EP受体亚型的实验可能为我们的药理学研究提供额外见解。

专注于Calu-3细胞能够对PGE₂产生CFTR非依赖性Cl^?分泌的机制，确定了Ca²⁺_e进入的关键作用，来自顶端和基底侧。先前对Calu-3细胞的研究发现，thapsigargin刺激（动员Ca²⁺_i）需要CFTR用于Cl^?分泌。嘌呤能受体在CF中因其能够刺激替代CaCCs和抑制Na⁺吸收而被靶向。吸入性denufosol，一种P2Y2激活剂，曾作为CF疗法 pursued，但在晚期临床试验中未能显示肺功能改善。P2X受体激活也被显示刺激CF和非CF气道中的持续气道Cl^?分泌。与P2Y2受体（刺激Ca²⁺_i释放）不同，P2X受体激活刺激Ca²⁺_e进入。在当前研究中，发现EP4介导的Calu-3细胞中的Cl^?分泌不仅涉及通过P2X受体的Ca²⁺_e信号，还涉及TRPV和CRACs。利用多种不同Ca²⁺进入机制突出了Ca²⁺_e对Calu-3细胞中CFTR非依赖性机制的重要性。还确定了Src、PI3K和SGK1信号在CFTR非依赖性Cl^?分泌中的作用。Src和PI3K是PGE₂和EP4信号的知名效应器。SGK1，虽然先前未 implicated in PGE₂信号，是离子通道的知名调节剂，包括TRPV和CRACs。相反，Ca²⁺_i增加也能增加SGK1表达和活性。进一步研究SGK1活性与P2X、TRPV和CRACs之间的相互作用可能为调节气道Cl^?分泌提供新的治疗机会。

解释实验时，应注意一些技术细节。实验检查了可能驱动CFTR_inh-172不敏感Cl^?分泌的机制。CFTR_inh-172抑制被用作测量无功能CFTR细胞中可能发生的情况的代理。未在来自CF或COPD个体的黏膜下腺中进行实验，因此无法确认结果是否适用于这些具有遗传性或获得性CFTR功能障碍的个体。I_sc是跨顶端和基底侧膜的多种离子通道的离子转运的复合测量，尽管实验设计有利于I_sc反映基底侧向顶端Cl^?分泌，至少部分反映Ca²⁺进入。不能排除其他离子通道的潜在参与，如K⁺通道，这可能也反映在I_sc中或有助于Cl^?分泌。由于CFTR_inh-172的黄色干扰测量，无法用其进行Ca²⁺_i成像。GlyH-101的白色也排除了其使用。因此，选择使用glibenclamide，已广泛用于抑制CFTR（包括在Calu-3细胞中）并显示类似抑制人CFTR的功效。尽管glibenclamide可以抑制K⁺_ATP通道，但据所知，K⁺_ATP通道不在Calu-3细胞或气道黏膜下腺细胞中表达。最后，鉴于测试的各种条件，实际上无法对所有条件进行同时平行测试，但每次测试的细胞传代中都包含了对照。

在评估研究发现的可转化性时，有几个因素值得考虑。在发炎的CF和COPD气道中，有丰富的底物（PGE₂）可用。此外，慢性IL-1β，在阻塞性肺病早期增加，可能减少PTGER4 mRNA。然而，大多数这些数据来自测量支气管肺泡灌洗样本或研究HBE细胞，产生与气道表面相关的信息。尽管黏膜下腺的增生和黏液阻塞发生在阻塞性肺病发病机制早期，但尚不清楚这可能如何改变其对靶向EP4激活的反应能力。野生型和CFTR^?/?猪的单细胞RNA测序显示黏膜下腺中PTGER1-4 mRNA表达无变化。CF HBE细胞的类似测序显示PTGER4 mRNA表达无改变证据，尽管PTGER2 mRNA增加。因此，尚不清楚靶向EP4激活或其下游效应器，特别是在黏膜下腺中，是否具有治疗益处。未来使用原代人黏膜下腺或体内黏膜下腺定向EP4或SGK1激活在动物模型中的实验可能为此提供见解。

结论

通过一系列功能性离子转运、mRNA表达和Ca²⁺_i成像实验，建立了一种机制， whereby PGE₂刺激Calu-3细胞中的Cl^?分泌 independent of CFTR功能。尽管在原代人黏膜下腺或动物模型中的验证可能确定靶向我们所识别机制的适用性，但识别潜在Cl^?分泌增强途径的前景可能受益于缺乏有效疗法来 alleviating肺部疾病的CFTR功能受损的阻塞性肺病患者。