高氧与抗生素通过调控肺间充质细胞影响实验性支气管肺发育不良的机制研究

本研究发现高氧（Hyperoxia）和抗生素暴露通过改变肺间充质细胞（L-MSCs）的转录组和细胞分布，影响肺泡微血管发育，揭示了支气管肺发育不良（BPD）的新机制，为早产儿BPD防治提供了潜在靶点。

　　

引言

支气管肺发育不良（Bronchopulmonary Dysplasia, BPD）是早产儿最常见的并发症，显著增加早期肺气肿和哮喘风险。BPD的特征是肺泡和微血管发育受阻，病因包括高氧、炎症和菌群失调。目前缺乏有效治疗手段，深入研究其机制至关重要。肺间充质基质细胞（Lung Mesenchymal Stromal Cells, L-MSCs）在肺泡微血管化、修复和再生中起关键作用。本研究利用高氧诱导的BPD小鼠模型，探讨高氧和抗生素导致的细菌负荷减少对L-MSCs和肺泡发育的直接影响。

材料与方法

研究使用C57Bl/6OlaHsd孕鼠，从胚胎第15天（E15）至出生后第21天（P21）随机给予抗生素（氨苄青霉素、庆大霉素、万古霉素）或正常饮水。新生鼠从P4至P14暴露于85%高氧环境，之后恢复常氧至P21。通过16S rRNA qPCR检测肠道细菌负荷，H&E染色和D2评分评估肺泡空间大小，免疫荧光染色分析微血管密度（vWF和内皮膜蛋白标记）。流式细胞术分选L-MSCs（CD45^NEGCD31^NEGEpCAM^NEGLY6A^POS），并进行RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）。分泌组分析使用蛋白质阵列芯片，巨噬细胞分选通过CD115微珠完成。

结果

高氧和抗生素降低微血管发育

抗生素处理显著降低肠道细菌负荷（7倍）。高氧暴露导致P14和P21肺泡简化（D2评分增加），但抗生素未加重肺泡损伤。然而，高氧和抗生素均损害肺微血管发育，vWF阳性血管面积减少，且抗生素在高氧基础上进一步降低血管密度。

L-MSC亚群分泌（抗）血管生成蛋白的失衡

PDGFRα^POS L-MSCs分泌多种血管生成蛋白（如HGF、MCP-1、SPP1），高氧上调F3、HGF等表达。MCAM^POS L-MSCs分泌蛋白在高氧下普遍下调，而LY6A^POS L-MSCs分泌较少血管生成因子，但抗生素和高氧联合处理改变IGFBP-2和PAI1水平。

高氧和抗生素增加肺泡巨噬细胞

P8时高氧暴露使肺泡巨噬细胞（aMF, CD45^POSCD11c^POSSiglecF^POSCD11b^POS）比例升高，抗生素无叠加效应。间质巨噬细胞（iMF）在P21减少，且MHCII表达增加。高氧还导致SiglecF^POSCD11b^POS巨噬细胞增多，抗生素进一步加剧此现象。

LY6A^POS L-MSCs影响肥大细胞相关基因

高氧减少P21时LY6A^POS L-MSCs数量。RNA-seq发现P14时103个差异表达基因，其中10个与肥大细胞相关（如Csf2rb2、Dapp1、Ahr）。抗生素处理增强高氧对Csf2rb2、Dapp1等基因的影响。免疫荧光证实CSF2RB蛋白表达在高氧和抗生素组改变，空间分布异常。

高氧和抗生素改变L-MSC群体分布

scRNA-seq（P8）显示10个细胞群，包括8个间充质群体：P2RY14^POS肺泡肌成纤维细胞（AMF）、Col14a1^POS基质成纤维细胞（MF）、Col13a1^POS MF、血管平滑肌细胞（VSMC）、周细胞、增殖性间充质祖细胞（PMP）、气道平滑肌细胞（ASMC）和间皮细胞。高氧减少周细胞、PMP、Col13a1^POS MF和AMF数量，增加Col14a1^POS MF、VSMC和ASMC。抗生素单独处理也减少Col13a1^POS MF和PMP，增加Col14a1^POS MF和VSMC。

Pdgfrα^POS、Mcam^POS和Ly6a^POS L-MSCs受高氧和抗生素影响

scRNA-seq显示Pdgfrα表达于AMF和PMP，高氧和抗生素降低其表达。Mcam主要表达于周细胞，高氧减少周细胞中的Mcam表达。Ly6a表达细胞在抗生素和高氧下增加，主要位于Col14a1^POS MF群体。分泌组与scRNA-seq数据部分一致，但培养条件可能影响结果。

讨论

本研究揭示高氧和抗生素通过改变L-MSCs转录组和细胞分布，影响肺泡微血管发育和免疫细胞平衡。抗生素虽不加重肺泡简化，但显著损害微血管发育，并增加SiglecF^POSCD11b^POS巨噬细胞，后者与BPD肺泡发育不良相关。LY6A^POS L-MSCs的肥大细胞相关基因改变提示与肥大细胞的交互作用可能参与BPD炎症和纤维化。scRNA-seq发现高氧早期（P8）即减少周细胞和AMF，影响血管稳定性和修复功能。抗生素单独处理也改变L-MSC组成，表明菌群失调直接参与肺发育调控。

数据可用性

RNA-seq和scRNA-seq数据保存于NCBI GEO（登录号GSE276454和GSE276396）。

补充材料

包括附图S1-S2和表S1-S7。

致谢

感谢 Erasmus Medical Center 的技术支持。

基金

由荷兰肺基金会、Sophia儿童医院研究基金会和10x Genomics资助。

利益声明

无利益冲突。

作者贡献

多位作者共同完成实验设计、数据分析和论文撰写。