引言肥胖是一种异质性疾病，与糖尿病、肝病、心血管疾病及至少13种癌症的发病风险增加密切相关。在美国，约五分之二的成年人和五分之一的儿童患有肥胖，预计到2030年，超过50%的美国成年人将面临肥胖问题。为应对这一日益严重的流行病，迫切需要更精确的个性化减重和体重维持策略。热量限制（CR）作为一种成熟的饮食减重策略，比药物或手术干预风险更小、成本更低。然而，CR对许多人而言难以坚持，且缺乏基于机制的指导来预测谁会对CR产生良好的减重反应。因此，识别个体对CR诱导减重抵抗的方法有望为制定个性化体重管理计划提供信息。尽管小鼠模型已广泛用于机制研究，如饮食诱导肥胖（DIO）、肥胖相关疾病及减重干预（包括CR），但通常使用的近交系小鼠遗传变异性小，这限制了研究肥胖异质性及减重反应的能力。多样性远交（DO）小鼠模型的开发正是为了克服这一局限，并重现人类群体中观察到的显著遗传多样性。DO小鼠源自八个近交系创始品系，通过非兄弟姐妹随机远交产生，具有遗传和表型独特的小鼠，涉及约4500万个单核苷酸多态性和结构变异，且其遗传变异均匀分布，在大多数基因的编码区存在多个等位基因变异，这引入了蛋白质功能的细微变化，驱动表型异质性，包括对CR可能的多基因反应。DO小鼠还表现出异质性表观遗传标记，包括差异DNA和组蛋白甲基化，为特定表型增加了另一个异质性驱动因素。因此，DO小鼠为模拟饮食干预反应的变化提供了强大工具。在这项原理验证研究中，我们旨在确定在遗传和表型多样的小鼠群体中，识别CR诱导减重反应性的代谢预测因子的可行性。具体而言，我们表征了300只DO小鼠（150只雄性和150只雌性）的表型和代谢反应，包括体重和身体成分、血糖以及9种代谢激素的血浆水平，这些指标在12周DIO和8周CR后进行评估。然后，我们使用逻辑回归来识别肥胖DO小鼠中对CR诱导减重抵抗的性别特异性、机制上合理的系统预测因子。材料与方法所有程序均获得北卡罗来纳研究园区机构动物护理和使用委员会的批准。总共300只成年DO小鼠（150只雄性和150只雌性，均非兄弟姐妹）从杰克逊实验室购买（品系编号009376），年龄为8周，饲养在24°C、12小时光暗循环下。到达后，小鼠群居饲养，适应2周，随后在10周龄时提供DIO饮食（60 kcal%脂肪；研究饮食公司，Cat. No. D12492）自由采食12周。然后，所有小鼠随机分配到单独笼中，自由采食对照饮食（10 kcal%脂肪；研究饮食公司Cat. No. D12450J）3天，随后给予30% CR饮食（Bio-Serv, Cat. No. F0078）8周。为实现CR方案，所有小鼠每天获得一份食物，提供3天平均能量摄入的70%以及对照饮食方案期间消耗的100%维生素、矿物质和氨基酸。在此期间，雄性每日食物摄入中位数（范围）为3.3克（0.02–12克），而雌性为2.8克（0.2–11.8克）。完成8周CR后，所有小鼠在光周期开始后禁食4小时，随后实施安乐死。人道终点包括一周内体重减轻>20%、显著痛苦迹象（毛发蓬乱或弓背姿势）或疾病。样本量基于我们之前对DO小鼠的工作以及Churchill等人的建议，后者基于“最坏情况”方法（私有等位基因频率1/8，具有隐性效应）推荐大多数DO研究的样本量>200。相关基因型因此发生在研究群体的1.5%中，而将性状平均值移动一个标准差的隐性效应将被视为具有生物学重要性。二项式计算表明，n = 300将在所有位点中实现20%的隐性基因型覆盖率，使用显著性水平0.05和统计功效0.80的统计测试达到所需覆盖水平。在20周的饮食干预期间，29只小鼠自发死亡（20只雄性：14只在DIO诱导期，6只在CR治疗期；9只雌性：6只在DIO诱导期，3只在CR治疗期），并在死亡时进行审查。本研究未跟踪雌性的动情周期。研究评估包括每周使用校准秤测量体重。在基线、DIO后和CR后使用EchoMRI-100H分析仪评估身体成分，包括体脂肪量和瘦体重。在基线、DIO后和CR后禁食4小时后，通过眶后眼采血收集血液到K2EDTA涂层管中。收集的血液用于：1）使用OneTouch Ultra 2血糖仪测量血糖；2）血浆处理。对于血浆处理，K2EDTA涂层管置于冰上，在4°C下以2000 rpm离心10分钟，血浆在-80°C下储存直至激素分析。使用Bio-Plex多重免疫测定法测量血浆饥饿素（ghrelin）、葡萄糖依赖性胰岛素多肽（GIP）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、胰岛素（insulin）、瘦素（leptin）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、抵抗素（resistin）、胰高血糖素（glucagon）和脂联素（adiponectin），并在Bio-Plex MAGPIX多重读板器上分析。基于胰岛素和血糖水平计算稳态模型评估的胰岛素抵抗（HOMA-IR），如前所述。数据分析和统计由于潜在的性别二态性，对雄性和雌性小鼠分别进行分析。统计显著性设定为P < 0.05。所有数据使用GraphPad Prism9和R（v. 4.3.0）分析，并使用Wilks-Shapiro和D’Agostino-Pearson omnibus正态性检验测试正态性。这是一项纵向研究，每只小鼠作为其自身对照。体重、身体成分和大多数激素比较数据使用双向重复测量ANOVA分析，随后进行Tukey多重比较事后检验。对于饥饿素、GIP、GLP-1和脂联素的比较，使用双向混合效应模型，因为这些激素的某些浓度值低于Bio-Plex多重免疫测定的检测下限。体重百分比变化、身体成分百分比变化和激素数据使用双向ANOVA分析，随后进行Fisher最小显著差异（LSD）事后检验。使用R进行回归建模，以量化肥胖小鼠中激素和HOMA-IR水平与CR诱导的相对体重变化之间的关联。CR后体重减轻百分比处于下四分位和上四分位的DIO小鼠分别被视为CR“无反应者”和“反应者”。在比较无反应者与反应者时，激素浓度和HOMA-IR水平在进行逻辑回归建模前进行对数转换和z得分标准化。数据以回归系数、标准偏差和P值呈现。结果DO小鼠对DIO和CR的异质性体重和身体成分反应在150只雄性和150只雌性DO小鼠中，12周DIO导致体重增加，而8周CR通常导致体重减轻；体重和体重轨迹显示出显著的异质性。一致地，雄性体重高于雌性，基线中位体重分别为23.9克 versus 19.9克；DIO后为44.9克 versus 35.9克；CR后为35.4克 versus 26.4克（每次比较P < 0.0001）。然而，在任一种饮食干预后的体重百分比变化中未检测到性别间差异（每次比较P > 0.99）。DIO促进雄性体重百分比变化中位数（范围）为85.6%（19.9%–164.8%），雌性为77.2%（24.7%–189.3%），而CR促进雄性体重百分比变化为-21.2%（-57.7%至23.5%），雌性为-23.5%（-57.0%至5.9%）。DIO促进雄性体重变化中位数（范围）为13.0克（0.9–31.33克），雌性为10.6克（1.2–27.2克），而CR促进雄性体重百分比变化为-6.5克（-23.6至8.1克），雌性为-23.5%（-57.0%至5.9%）。DIO导致DO小鼠脂肪质量占体重百分比增加，瘦质量百分比相应减少，而CR具有相反效果。这些反应在个体间存在相当大的异质性。DIO后瘦质量百分比减少在雄性中比雌性更显著（相对于基线中位数减少：25.0% vs. 20.6%，P = 0.025）。重要的是，这不是瘦质量的损失，而是由于脂肪质量增加导致的身体成分变化。CR增加瘦质量百分比在雄性中少于雌性（相对于饮食切换中位数增加：13.6% vs. 10.2%，P = 0.002），此外降低脂肪质量百分比在雄性中少于雌性（相对于饮食切换中位数减少：10.0% vs. 13.3%，P = 0.004）。绝对脂肪质量变化中位数（范围）在DIO后雄性为13.0克（0.9–31.33克），雌性为10.6克（1.2–27.2克），而CR促进脂肪质量变化雄性为-6.5克（-23.6至8.1克），雌性为-6.7克（-25.0至2.6克）。对于绝对瘦质量，DIO促进的瘦质量变化中位数（范围）在DIO后雄性为5.9克（-2.1至12.99克），雌性为4.4克（1.2–11.1克），而CR促进的瘦质量变化雄性为-2.1克（-9.7至3.6克），雌性为-0.9克（-6.6至1.8克）。DO小鼠对DIO和CR的异质性代谢反应每种性别的DO小鼠在基线、从DIO切换到CR时（DIO后）和研究结束时（CR后）在1）血糖水平、HOMA-IR和九种代谢激素（饥饿素、GIP、GLP-1、胰岛素、瘦素、PAI-1、抵抗素、胰高血糖素和脂联素）的血浆水平方面表现出显著的异质性；2）从基线到饮食切换和从饮食切换到CR的这些指标的百分比变化。在基线时，雄性循环葡萄糖、胰岛素、PAI-1和胰高血糖素显著高于雌性，而血浆饥饿素、瘦素、抵抗素和脂联素显著低于雌性（每次P < 0.03）。血糖和HOMA-IR在雄性和雌性小鼠中均随DIO显著增加，随后随CR减少。饮食切换时血糖变化中位数（范围）从基线增加雄性为23%（53.3%–228.9%），雌性为17.2%（48.2%–180.4%），而CR后血糖变化雄性为-47.1%（92.5%至55.9%），雌性为-40%（-82.6%–109.8%）。饮食切换时HOMA-IR变化中位数（范围）从基线增加雄性为167.6%（-72.3–1,722%），雌性为37.3%（-65.7–1,436%），而CR后HOMA-IR变化雄性为-75.5%（-99%至302.1%），雌性为-55.3%（-96.3%至982.2%）。在雄性和雌性小鼠中，血浆水平发生显著变化：1）瘦素、抵抗素、脂联素和GIP在DIO和CR后；2）胰岛素和PAI-1在DIO后；3）饥饿素在CR后。DIO还导致雌性饥饿素和GLP-1水平显著变化，而CR（相对于DIO）诱导雄性胰岛素和GLP-1血浆水平以及雌性PAI-1显著变化。胰高血糖素水平对DIO或CR无显著反应。对每种饮食干预最敏感的激素是瘦素，其通常随DIO增加（从基线变化中位数（范围）：雄性1,207%（-78.1至12,546%），雌性525.4%（-66至5,531%）），并通常随CR减少（相对于DIO变化中位数（范围）：雄性-71.9%（-99%至952%），雌性-70.5%（-97.8%至209.9%））。相比之下，其他激素的百分比变化中位数在雄性和雌性中，DIO后从-2.9%到85.6%变化，CR后从-47.6%到106.2%变化。血浆胰岛素、GIP和（仅雄性）抵抗素在研究完成时恢复到基线水平。代谢标志物水平的变异系数（CVs）在雄性和雌性小鼠之间相似，除了脂联素在CR后雌性中变异性显著大于雄性。CR诱导减重抵抗的预测因子我们根据CR诱导体重减轻百分比的上四分位和下四分位将DIO小鼠分类为CR反应者和无反应者。在每种性别中，无反应者的体重和脂肪质量显著高于CR反应者，而瘦质量显著较低。在逻辑回归分析中，与CR反应者相比，CR无反应者在两性中均具有显著较低的瘦素水平；雌性中较低的PAI-1、胰岛素、抵抗素和HOMA-IR水平以及较高的饥饿素水平；雄性中较低的葡萄糖水平。讨论使用300只遗传多样化的DO小鼠（150只雄性和150只雌性），我们证明了1）它们的体重和身体成分、循环葡萄糖和代谢激素以及对增重（DIO）和减重（CR）饮食干预的反应存在性别二态性；2）DIO和CR各自诱导了异质性的表型和代谢反应；3）在肥胖DO小鼠中测量的较低胰岛素、PAI-1、抵抗素、HOMA-IR和较高饥饿素水平（均仅雌性）以及较低葡萄糖水平（仅雄性）预测了对CR诱导减重的抵抗；4）肥胖DO小鼠中较低的循环瘦素水平预测了每种性别中对CR诱导减重的抵抗。尽管在近交系小鼠中对DIO和CR的代谢变化已有充分描述，但我们的研究是首个在肥胖DO小鼠中识别CR诱导减重抵抗的代谢预测因子的研究。此外，DO小鼠中的性别二态性重现了低热量饮食诱导的人类体重和心脏代谢风险因素的变化。总之，这些临床前发现提供了原理证明，即DO小鼠的遗传和表型异质性（模拟人类遗传多样性）可用于识别体重 loss 干预结果的机制预测因子。这些循环预测因子可能为体重管理策略的决策提供信息，以实现更精确的体重管理方法。CR反应者和无反应者在对CR的反应上表现出统计学显著差异，特别是在体重和身体成分方面。这些组之间的一个关键区别是它们在饮食切换时的中位体重（DIO后），反应者体重显著高于无反应者。然而，在DIO期间的体重增加百分比在两性中反应者和无反应者之间相似。这表明，就体重变化而言，CR反应性与对DIO的反应无关。瘦素是受DIO和CR影响最大的代谢激素，降低的瘦素水平以性别无关的方式预测了对CR诱导减重的抵抗。瘦素调节生长、能量消耗、血糖控制、食物摄入和肾上腺皮质类固醇的产生。关于人类体重 loss 干预前瘦素浓度与干预反应之间关系的文献结果不一，可能由于涉及不同的持续时间和减重策略。例如，在肥胖成人的饮食减重研究中，高基线瘦素水平伴随瘦素浓度的初始降低预测了长期减重，与我们的发现一致。相反，在其他涉及数量有限的肥胖成人的研究中，较低的初始瘦素水平与更多减重相关。部分地，瘦素水平能够独立于性别预测CR诱导减重的能力可能源于其与雄激素和雌激素的相互作用。青春期晚期男孩的瘦素与脂肪质量比率与睾酮浓度呈显著负相关。这种瘦素和睾酮之间的调节部分得到体外实验的支持，其中脂肪组织与睾酮孵育导致瘦素mRNA表达减少。相反，在青春期女孩中，瘦素与脂肪质量比率和雌二醇浓度无显著相关性。然而，雌激素缺乏导致啮齿动物中枢瘦素不敏感性。连接瘦素和雌激素信号的潜在机制，由Gonzalez-Garcia等人全面描述，涉及Cbp/P300相互作用转录激活因子与Glu/Asp-rich羧基末端结构域1（Cited1），其作为下丘脑内瘦素和雌二醇信号汇聚的辅因子，减少食物摄入。这可能部分解释了为何育龄女性比男性对代谢疾病有更多保护。这种机制也在给予外源性雌二醇的高脂高蔗糖饮食雄性小鼠中观察到；然而，在Cited1敲除（KO）雄性小鼠中这种效应被减轻。瘦素和雌激素信号的汇聚在人类中也 evident；接受雌二醇激素替代治疗的男性循环瘦素浓度增加160%–180%。需要进一步研究以确定瘦素预测肥胖人类CR反应性的能力。先前的报告表明， distinct 的性别二态性特征导致人类和啮齿动物对肥胖的不同反应，因此可能指向体重 loss 敏感性或抵抗的性别特异性系统代谢预测因子。降低的PAI-1（一种靶向纤溶酶原激活剂并调节纤溶的丝氨酸蛋白酶抑制剂）与雌性DO小鼠中对CR诱导减重的抵抗相关。增加的PAI-1浓度与肥胖相关，并在啮齿动物和人类中由内皮和脂肪组织产生。关于PAI-1表达存在性别二态性的文献有限，尽管一项小鼠研究发现主动脉PAI-1表达在雄性中低于雌性。体外研究表明雌激素水平可能 contribute to PAI-1的性别二态性，因为外源性17β-雌二醇增加培养的人脐静脉内皮细胞中PAI-1表达。较高的饥饿素（一种调节多种代谢功能包括食物摄入、体重和能量稳态的激素）也与雌性DO小鼠中对CR诱导减重的抵抗相关。在啮齿动物和人类中，饥饿素浓度在低营养可用性时升高，而餐后存在低饥饿素浓度。循环饥饿素浓度也存在性别二态性，雌性啮齿动物和女性浓度高于雄性，与本研究中的发现一致。观察到的饥饿素水平性别二态性可能通过胃泌素产生细胞上雌激素受体α（ERα）的表达介导，因为在大鼠中，胃中饥饿素表达和分泌在雌激素激活后增加。此外，喂食高脂饮食的雄性饥饿素（Ghrl）KO小鼠比野生型对应物增重更少，而雌性野生型和KO小鼠均抵抗体重增加。抵抗素主要在啮齿动物中由脂肪组织分泌，而在人类中，抵抗素由巨噬细胞、单核细胞以及较小程度的脂肪细胞分泌。降低的抵抗素水平与雌性DO小鼠中对CR诱导减重的抵抗相关。在人类和啮齿动物中，女性基础循环抵抗素浓度高于雄性，如本研究所观察。抵抗素基因（Retn）在其调控区具有雌激素反应元件，并在体外被外源性17β-雌二醇上调。然而，给予外源性17β-雌二醇的卵巢切除啮齿动物脂肪组织中抵抗素表达减少。相反，接受睾酮替代治疗的患有2型糖尿病的性腺功能减退男性在治疗后循环抵抗素浓度无变化。在本研究中，在DO小鼠中，雌性在饮食切换时（DIO后）脂肪质量百分比增加与雄性相同；然而，CR后雌性脂肪质量百分比下降大于雄性。雌激素对抵抗素表达的潜在调节 coupled with CR诱导减重对脂肪质量百分比的性别特异性影响可能解释了为何抵抗素是雌性而非雄性的CR诱导减重预测因子。本研究中CR诱导减重的其他性别特异性代谢预测因子包括雌性中的胰岛素和HOMA-IR以及雄性中的葡萄糖。葡萄糖代谢在人类和啮齿动物中因性别而异是众所周知的。此外，这种性别二态性已与差异雌激素浓度相关联，可能通过Erα激活AKT-FOXO1信号通路。DO小鼠模型的开发是为了解决大多数啮齿动物研究中典型的遗传和表型变异缺乏问题。DO小鼠拥有约4500万个单核苷酸多态性和数百万个结构变异，导致其对饮食和其他干预的代谢反应具有人类般的异质性。我们还预期DO小鼠拥有活动水平谱，这可能影响了CR期间减轻的体重量。因此，研究的一个限制是我们无法量化食物摄入或能量消耗。本研究的另一个限制是我们未跟踪雌性的动情周期或测量17-β雌二醇，因此无法解释可能影响测量的代谢激素水平的动情周期差异。此外，DIO对CR反应者和无反应者的潜在代谢影响仍不确定，它可能影响了CR反应性。因此，未来的研究将侧重于表征CR反应者和无反应者的遗传谱，以识别与CR介导减重和DIO介导增重相关的潜在遗传特征。尽管我们显示DO小鼠具有高度异质性，但我们也证明代谢标志物水平的CVs在雄性和雌性小鼠之间相似，除了脂联素。脂联素水平在CR后雌性中变异性显著大于雄性。这种一致性支持了我们结果的普遍性，并增强了我们分析的统计功效，允许在雄性和雌性之间进行更准确的比较。此外，我们的发现表明雄性和雌性对DIO和CR有相似的反应，表明以变异性更高为由将雌性排除在肥胖研究之外的理由不成立。总之，我们确立了使用具有人类般遗传和表型异质性小鼠的DO小鼠来识别代谢预测因子（特别是两性中的瘦素）对CR诱导减重反应性的可行性。未来的研究计划侧重于确定CR反应性的机制基础，包括不同组织中的细胞信号通路，并将探究小鼠的遗传谱如何 contribute to 这些反应。目前正在进行额外研究，以通过DO小鼠中的CR将我们对CR诱导减重代谢预测因子的原理验证发现转化为其他减重干预，如肠促胰岛素模拟疗法或减肥手术。数据可用性本研究分析的数据集可在https://doi.org/10.15139/S3/RPIOV9获取。补充材料补充图S1–S3和补充表S1：https://doi.org/10.15139/S3/RPIOV9。致谢BioRender用于创建图形摘要。[创建于BioRender。Paules, E. M. (2025) https://BioRender.com/k70y413]。资助本研究得到美国国立卫生研究院拨款R35 CA197627（致S.D.H.）和P30 DK056350（致S.D.H.和J.E.F.）支持。北卡罗来纳大学教堂山分校（UNC-CH）副校长创造力中心试点奖（致P.G.-L.、J.E.F.、S.D.H.、A.G.H.、K.E.N.、M.V.和K.A.M.）。免责声明Balchem在研究设计、数据收集、分析或手稿准备中无任何角色。披露Evan M. Paules是UNC营养研究所的Balchem博士后。其他作者无任何利益冲突，财务或其他，需要披露。作者贡献K.E.N.、A.G.H.、P.G.-L.、J.E.F.和S.D.H.构思和设计研究；M.V.、K.A.M.、M.F.C.和J.A.进行实验；E.M.P.、A.A.L.和K.E.N.分析数据；E.M.P.、B.J.B.、I.T.-G.、J.E.F.和S.D.H.解释实验结果；E.M.P.准备图表；E.M.P.和S.D.H.起草手稿；E.M.P.、A.G.H.、P.G.-L.、I.T.-G.和S.D.H.编辑和修订手稿；E.M.P.和S.D.H.批准最终版本手稿。作者注? 通讯作者：S. D. Hursting (hursting@email.unc.edu)。
