界面水量子跃迁模型（IWQ）：揭示恒温动物体温的分子起源与血红蛋白温度依赖性功能转换新机制

本综述创新性提出界面水量子跃迁（IWQ）模型，深刻阐释了蛋白质中观察到的温度依赖性结构与功能转换（不连续性）现象。核心观点指出：实验测定的临界温度（TC）与由蛋白质-水界面暂时游离水分子旋转量子跃迁定义的物理参考温度（TW）相关。该模型成功应用于血红蛋白（Hb）和热敏瞬时受体电位（TRP）通道等差异巨大的模型系统，并揭示了其作为定义恒温动物（如人类TW = 36.32°C）基础体温物理机制的潜力。文章进一步通过未发表数据证实，人与鸡的体温不仅与量子跃迁参考温度重合，且与血红蛋白氧饱和度的显著转变相关，暗示了氧气供给关键参数与水量子物理旋转跃迁温度间的 interplay 可能是恒温物种体温进化的主导因素。简言之：蛋白质感知温度，而水设定关键的生理温度。

　　

引言

恒温物种的体温通过涉及热传感器和效应器的复杂调节回路保持在相对狭窄的范围内。尽管经过了无数人年的研究，可用的体温数据，尤其是人类的，仍然是受许多因素影响的实验测定值。一个关键问题是，是否存在一个独立的物理机制来为恒温物种建立参考体温。对红细胞（RBCs）的偶然发现引发了本研究主题的探索。

界面水量子跃迁模型

水溶液中的热膨胀球形模型蛋白

在水性生理环境中，大多数非极性氨基酸残基因其疏水性而被隔离在蛋白质核心中，动态性不强。主要亲水的外侧链与邻近的水一起构成了整体的蛋白质-水界面。蛋白质的热膨胀系数是高度各向异性的，这主要是由于非水合内部空腔的影响，即内部范德华（vdW）相互作用密度的变化。

蛋白质-水界面的形貌和动力学

蛋白质表面亲水和疏水区域的分布是温度依赖性的，由于近表面蛋白质结构的各向异性热膨胀。随着热能的增加，二级和三级蛋白质结构元件倾向于去稳定化，并且可能发生明显的结构转变。该过程通常在温度上呈S形。同时，蛋白质-水界面的动力学增加。在极性表面区域，非均匀分布的氢键在蛋白质和相邻水之间形成不规则的网络。它们不断地形成和断裂；只有一些是长寿命的。相比之下，非极性疏水表面区域被不与蛋白质氢键结合的水分子簇覆盖，这些被称为腔包裹水。由此产生的拓扑轮廓是动态的。

在热膨胀过程中，额外的疏水成分暴露在蛋白质表面，随之而来的是几何形状和水合作用的变化。将 bulk water 转移到新暴露的（疏水）表面区域需要溶剂化功，这有助于蛋白质和溶剂重构的能量学。水分子的平移和旋转动力学通常在界面区域因与蛋白质残基的氢键以及体积排阻效应而减慢。可以合理地假设，特别是在缺乏蛋白质与水之间氢键的疏水位点，动力学失配可能导致溶剂分子密度降低的区域暂时出现。

游离水分子的旋转量子跃迁

水以两种异构形式存在：质子自旋J=0的顺式水（p-water）和J=1的反式水（o-water）。在它们的未结合（类气体）形式中，两种异构体都经历量子物理分子旋转，涉及由量子数描述的 distinct states。通过吸收或释放太赫兹电磁波谱中精确定义的量子能量，发生旋转状态之间的跃迁。

由于自旋守恒的作用，p-water 到 o-water 异构体之间的自发跃迁及其逆过程是量子力学禁止的。当 o- 和 p- 能级的能量接近时会出现例外。自旋转换也由一些生物学上重要的同位素作为催化剂在近距离 facilitated。其速率取决于催化剂的磁场梯度和密度。

过去，旋转光谱的分析主要限于气体，其中水分子可以自由旋转。尽管通过将水异构体嵌入 C₆₀ 富勒烯笼中可以产生类似的情况，其中它们不能形成氢键，但通常认为旋转跃迁在 bulk water 中由于广泛的氢键网络而被抑制。通过使用重蒸馏液态水以及DNA或蛋白质溶液的实验，以及最近的量子力学分子动力学（MD）模拟，使这种基本正确的观点相对化了。后者强调了液态水中氢键密度的统计分布。除了高度占据的状态（每个水分子3或4个H键）之外，还有配位数较低的状态。事实上，发现纯水中约2%的水分子在任何给定时间都是未结合的，这将允许短暂的量子旋转，同时不质疑关于此类跃迁被广泛抑制的基本陈述。此外，众所周知，氢键网络随着温度升高而变得更加动态，预计瞬时游离水分子的比例会增长。除了纯水中氢键密度的波动之外，溶剂化大分子上的疏水斑块很可能构成水量子旋转的热点，因为有利于游离水分子出现的低密度状态的 enhanced probability。有效疏水性假定在高曲率凹面元素中特别突出，这表明深而窄的非极性空腔应提供类蒸气水的最高概率。这些考虑支持了以下观点：无论是在纯水中还是在蛋白质-水界面中，一小部分短暂“游离”的水分子可用于旋转量子跃迁。

水溶性生物聚合物溶液中旋转跃迁的实验证据

气态水中的旋转跃迁可以用拉曼光谱和其他经典的红外光谱方法检测。然而，由于可用信号比例低、信噪比不利以及水的相当大的吸收，它们不太适合以足够的灵敏度解析液态水或蛋白质-水界面中的旋转跃迁。

在检测液态水中的旋转跃迁方面，相干激光光谱方法取得了重大进展。这些方法的特点是高光谱分辨率和优异的信噪比。这是因为两种水异构体的旋转光谱比通常用于研究液体中分子相互作用的振动光谱更依赖于分子质量。通过相干激光光谱，已经实验证明了纯液态水以及DNA和蛋白质水溶液中的旋转跃迁。重要的是，生物分子溶液的光谱与纯水不同，证实了蛋白质或DNA表面提供了促进溶剂量子跃迁的位点的概念。它们旋转光谱中的峰值振幅是游离水分子旋转跃迁数量及其在给定波数下与两个相干激光束电场相互作用（敏感性）的度量。在诱导样品体积中旋转跃迁的波数λ^-1处，光谱中出现峰值（共振）。在这些实验中，水异构体的旋转光谱因此成为溶解的生物分子的光谱指纹。

IWQ模型的机制基础

蛋白质-水界面中局部和暂时出现没有H键的游离水分子是IWQ模型的基本前提。此外，鉴于水（或任何物质）的温度与其成分的内能直接相关，我们采用这样的观点：当达到特征共振温度T_W时，可以启动旋转跃迁。在蛋白质结构扰动的温度范围内，实验经常揭示在临界温度T_C处发生转变，此时蛋白质功能或其他性质发生不连续变化。根据IWQ模型，这些转变可以通过蛋白质-水界面中游离水分子的能量吸收来解释。这些分子可能通过吸收由旋转量子态n和m分别定义的离散能量ΔE_n,m而发生旋转量子跃迁。假设此类过程由热碰撞能量k × T_W启动，则将每个跃迁与特征旋转跃迁温度T_W联系起来。所有涉及较低能量差的旋转量子态的物理上可能的旋转跃迁在达到特定T_W之前已经发生，从而有助于T_W以下的蛋白质表面能量景观。然而，在T_W及以上，吸收更高量子能量成为可能，其效果由界面中游离水分子的实际数量和分布决定。当受激水分子释放其能量并重新整合到氢键网络中时，这导致在蛋白质-水界面处局部能量沉积。我们提出术语“易感区域”用于指代蛋白质-水界面中可能发生旋转跃迁的区域。在任何给定温度下，可能存在几个这样的区域，其大小和分布是蛋白质特异性的。如果水介导的能量输入在T_W时进入这些易感区域足够高，蛋白质可能经历局部结构变化，从而获得新的构象平衡，这通常与蛋白质功能切换相关。

如果蛋白质在T_C处的温度依赖性转变期间吸收的能量（通常确定为焓变ΔH）已知，则可以通过所涉及的量子能量来估计通过旋转跃迁传递该量能量所需的水分子数量。随着温度持续升高，进一步的旋转跃迁被激发。由于蛋白质表面性质的变化，在每个旋转跃迁温度处，可以 addressing 部分或完全不同的易感区域组，导致进一步的构象变化。易感表面区域的概念不仅适用于可溶性蛋白质，也适用于膜整合蛋白质。显然，在这些情况下，通过水量子跃迁的局部能量积累仅限于溶剂暴露的区域或结构域。

IWQ模型假定，在可逆扰动范围内，许多明显的温度依赖性蛋白质结构和功能转变不能用蛋白质-水系统随温度升高的连续能量吸收来解释，而是需要在达到离散水旋转跃迁温度T_W后进行局部能量输入。因此，T_W可能代表在T_C观察到的蛋白质转变的物理定义的参考温度。由于T_W基于水分子的量子物理特性，它独立于溶液pH、化学势、盐浓度和水性环境中的其他蛋白质。

温度下降时会发生什么？当温度降至T_W以下时，引入局部蛋白质界面区域的能量被回收。在结构扰动阶段，IWQ转变应该是可逆的，除非受到次级反应的阻碍，例如蛋白质聚集或半永久性的热变性，就像一些温度敏感的TRP通道那样。

IWQ模型在人红细胞和血红蛋白中的应用

红细胞通过微管的温度转变（红细胞通道转变）

红细胞的胞质溶胶主要由自由悬浮的、几乎球形的Hb分子组成，形成一个拥挤的介质。它在生理浓度下表现出牛顿流动行为。红细胞的弛豫时间不仅由细胞膜粘度决定，还由胞质溶胶的粘度决定，随着温度升高至约40°C而线性单调下降。特别是，它在人体温度附近没有显示异常。

相比之下，将悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的红细胞在-2.3 kPa的高抽吸压力下通过1.3μm微管的通道实验揭示了在T_C = 36.3 ± 0.3°C时通道能力的一个非常尖锐且高度可重复的温度转变（红细胞通道转变）。低于T_C，红细胞阻塞移液管，而留在移液管外的球形红细胞尾部中的Hb浓度增加至50 g/dL。然而，从约37°C开始，它们无阻碍地通过。

应用IWQ模型，我们假定这是由在T_W = 36.32°C（p2₀₂-3₃₁）时Hb-水界面中的量子力学旋转跃迁引起的。这种转变导致胞质溶胶流体性突然下降。在测量精度范围内，温度T_C和T_W可以被认为是相同的；此外，它们对应于健康人的平均体温T_B = 36.6°C（99%范围35.3–37.7°C），因此可能实际上代表了人体体温的 basal limit。

为了测试水中氢的同位素状态是否对红细胞通道转变有影响，在含有氧化氘（D₂O）而不是H₂O的磷酸盐缓冲液中悬浮红细胞进行了微管实验。氘基氢键比氕基氢键稍强，因为氘（D）和氕（H）之间的质量差异，意味着蛋白质-溶剂和溶剂-溶剂相互作用的更高稳定性。因此，预计临界转变温度应转移到更高的值，我们确实观察到了这一点。红细胞通道的临界转变温度为T_C (D₂O) = 37.2°C，对应于向上偏移0.8°C。根据IWQ模型，我们将这个拐点分配给旋转跃迁 p9₈₂-9₉₁，其T_W = 37.09°C。

被困在微管口部的红细胞的温度转变（红细胞体积转变）

使用相同的移液管负压，但内径更小为1.1 μm，此时没有红细胞可以通过，测量了在34.5°C至39.5°C之间平衡红细胞体积ΔV/ΔT的温度依赖性。由于红细胞膜在 pipetting 过程中保持完整，抽吸力导致胞质溶胶压力增加。

因此，胞质溶胶 bulk water 通过水通道蛋白被挤出，直到达到平衡，这 presumably 由血红蛋白紧密结合的水量决定，血红蛋白是红细胞胞质溶胶中主要的胶体渗透剂。观察到的红细胞体积随温度升高而减少 thus 可归因于Hb结合水向 bulk water 的转化。换句话说，在这个温度区间内，Hb水合壳“融化”，结合水变成 bulk water。在T_C = 36.4 ± 0.7°C处发现了平衡红细胞体积的一个拐点（红细胞体积转变），再次与T_W = 36.32°C处的旋转跃迁 p2₀₂-3₃₁ 重合。温度下的体积损失（ΔV/ΔT）在T < T_C时相当陡峭（-10.3 fL/°C），但在T_C以上平坦至-2.4 fL/°C，表明Hb结合水的融化过程在T_C = T_W时基本完成。作为低于T_C时Hb结合水损失的进一步间接证据，我们注意到在血浆悬浮红细胞的NMR T₁测量中，T₁弛豫时间在这个温度范围内增加，但在转变温度以上几乎保持恒定。最终，在基于H₂O的缓冲液中，用1.1μm的更窄移液管不允许任何红细胞通过，但揭示了结合水向胞质溶胶 bulk 的释放，这先于T_C处的实际转变。有趣的观察是，水合层的融化（在实验精度内）在转变温度T_C结束，这表明水合水的损失可能通过改变表面暴露残基的动力学使蛋白质对量子吸收的能量吸收敏感，这在中子散射实验中也观察到了。

估计表明，施加的热能太小，无法解释两个移液管实验的拐点。所选温度范围内胞质溶胶胶体渗透压的微小差异也不可能引起转变。因此，我们认为经典的物理化学理论无法解释观察到的拐点的出现。结合温度依赖性动态光散射实验和Hb溶液粘度记录，上述数据支持这样的观点：水在T_C处的旋转跃迁导致Hb表面疏水性突然增加，使得Hb分子能够低摩擦滑动，从而实现使用1.3μm移液管的红细胞通道转变。注意我们指的是有效疏水性，它不能简单地从暴露在蛋白质表面的非极性部分的比例推导出来。事实上，具有不同极性的众多溶剂可及的侧链和主链原子以复杂而非平凡的方式合作，取决于它们的相对排列，以产生局部和全局的水合模式。因此，给定一组蛋白质表面元素的适度重排可能足以改变溶剂相互作用，并且尽管温度升高预计会导致部分解折叠并因此暴露额外的非极性侧链，但对全局疏水性的影响可能是不成比例的。我们为红细胞通道转变提出的机制与先前表达的观点根本不同。

更窄的1.1μm移液管不允许任何红细胞通过，但揭示了结合水向胞质溶胶 bulk 的释放，这先于T_C处的实际转变。有趣的观察是，水合层的融化在转变温度T_C结束，这表明水合水的损失可能通过改变表面暴露残基的动力学使蛋白质对量子吸收的能量吸收敏感。

旋转粘度计中Hb溶液的温度转变（Hb粘度转变）

为了排除红细胞膜相关的开关，例如红细胞膜与移液管内表面之间的粘附突然丧失或水通道蛋白的水渗透性突然变化，作为上述红细胞转变的原因，用旋转粘度计在5.89 s^-1的剪切速率下分析了浓缩的Hb溶液。连续温度步骤之间的平衡时间为15分钟。选择的Hb浓度是在微管红细胞通道期间红细胞球体中出现的浓度。

考虑IWQ模型，观察到的在T_C = 36.4°C的转变是由Hb-水界面中游离水分子的旋转跃迁 p2₀₂-3₃₁引起的。在约37°C时，发生了一个停滞，这导致观察到的高Hb浓度下粘度与浓度无关。36.4至37°C之间的粘度范围代表一个过渡状态。

对于数据的比较和解释，重要的是在胞质溶胶或Hb溶液中，微管实验和旋转粘度测量中都存在流体动力学剪切力。与粘度测量不同，然而，在移液管实验中，细胞水同时被排出到细胞外空间。红细胞的总体积减少，这意味着每个Hb分子的平均水含量也减少。在T_C = 36.4 ± 0.3°C以下，留在移液管外的红细胞球形部分中的Hb浓度增加至50 g/dL。我们观察到的作为温度函数的红细胞中水合水融化 off Hb 也必须在粘度计中成立，但与处于抽吸应力下的红细胞不同，每个Hb分子的平均水含量保持恒定。

在阿伦尼乌斯图中，33 g/dL Hb溶液的相对粘度ln(η/η₀)在23°C至42°C之间随1/T单调线性下降。没有拐点。相比之下，在Hb浓度为45和50 g/dL时，在T_C = 36.4°C处观察到Hb相对粘度的突然且显著的温度转变（Hb粘度转变）。直到T_C，Hb溶液粘度是浓度依赖性的，与预期和公布的数据一致。在T ～25°C和浓度33 g/dL、45 g/dL和50 g/dL时，游离 bulk water 分子数N_free与血红蛋白结合水分子数N_bound的比率估计为N_free/N_bound = 5.3、3.0和2.0，分别对应于相邻Hb分子之间大约七、四和三个分子层的游离 bulk water。尽管存在这些差异，阿伦尼乌斯图在所有三种情况下都产生了相同的表观活化能（在测量精度内为6.1 kcal/mol）。有趣的是，只有当由于Hb分子的紧密接近而严重限制平移扩散时，才观察到Hb粘度转变。在T_C = 36.4°C处的活化能跳跃量在45 g/dL时为ΔE_a = 45.2–6.1 kcal/mol = 39.4 kcal/mol，在50 g/dL时为ΔE_a = 87.6–6.1 kcal/mol = 81.5 kcal/mol。在～37°C时，较高Hb浓度的相对粘度的温度依赖性再次变化，切换到仅1.4 kcal/mol的表观活化能；这对应于相对于低温状态ΔE_a = 1.4–6.1 kcal/mol = -4.7 kcal/mol的差异。

应用IWQ模型，我们提出由水量子吸收在T_W = 36.32°C导致的Hb疏水性增加触发了浓缩Hb溶液中的流体动力学不稳定性。Hb界面中的第一水合壳包含约2,300个水分子。由于一个水分子在p2₀₂-3₃₁旋转跃迁处的能量吸收是已知的，从Hb分子包括其水合壳吸收的总能量可以估计提供粘度跳跃所需的水分子百分比。将上述活化能差异作为代理 yields 数字64和133分别用于45和50 g/dL的转变，仅占第一水合壳水分子的2.8%和5.8%。

这些温度转变的最终原因是水。即使在红细胞中钙诱导的胞质溶胶血红蛋白交联或溶液中的血红蛋白之后，我们发现在临界温度T_C = 36.4 ± 0.3°C处存在温度转变，再次与旋转跃迁 p2₀₂-3₃₁的T_W = 36.32°C重合。这意味着即使在蛋白质-蛋白质相互作用发生显著改变之后，T_C在温标上的位置仍然保持不变。正如预期的那样，钙对红细胞通过微管和Hb悬浮液粘度有强烈影响，证实环境因素影响由水旋转跃迁诱导的生物学效应。然而，转变本身总是在相同的温度下发生，这些温度是由量子物理学预先确定的。

血红蛋白溶液圆二色性（Hb CD转变）

在35°C至39°C的温度范围内，人血红蛋白的CD测量显示在222 nm处的椭圆率发生转变，表明α-螺旋含量加速减少。在不同CD仪器上的独立测量导致转变温度为T_C = 37.2 ± 0.6°C、T_C = 37.1 ± 0.5°C和T_C = 36.5 ± 0.5°C。我们将变化的T_C归因于样品体积中实际温度与设备上设置温度的系统偏差。正如Artmann等人报道的，CD转变独立于Hb氧合、pH和其他因素。

我们将水的旋转跃迁 p2₀₂-3₃₁在T_W = 36.32°C分配给这些临界温度。根据IWQ模型和我们对其