猪流行性腹泻病毒刺突蛋白新型B细胞表位1273NATYLNLTGE1282的鉴定与保守性分析

本研究针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速变异的刺突蛋白(S蛋白)，通过纯化病毒颗粒免疫小鼠制备七种单克隆抗体，首次鉴定出位于S2亚基的高度保守线性B细胞表位1273NATYLNLTGE1282。该表位在G1/G2基因群毒株中高度保守，为开发广谱血清学诊断工具和新型疫苗设计提供了关键分子靶点。

　　

在全球养猪业持续遭受猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)威胁的背景下，这种高致病性冠状病毒引起的仔猪急性腹泻、呕吐和脱水症状，导致新生仔猪死亡率高达80%-100%，造成巨大的经济损失。尽管现有疫苗广泛使用，但病毒刺突蛋白(Spike protein, S蛋白)的快速抗原变异导致疫苗保护效果不断下降，迫切需要对S蛋白保守抗原表位进行系统性研究。

为应对这一挑战，中国农业大学研究团队在《Animal Diseases》发表最新研究成果，通过创新性的抗原表位筛选策略，成功鉴定出位于PEDV S蛋白S2亚基的高度保守线性B细胞表位。研究人员采用纯化PEDV病毒颗粒作为免疫原，避免了传统重组蛋白表达可能造成的构象表位丢失，这一技术路线显著提高了筛选效率。

研究采用几个关键技术方法：首先通过蔗糖密度梯度离心纯化G2c基因型毒株TRS2021的完整病毒颗粒；利用真核表达系统构建S蛋白及其系列截短体；采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞株；结合免疫荧光 assay(IFA)和Western blot(WB)进行表位表征；最后通过丙氨酸扫描突变和系统进化分析验证表位保守性。

Results主要研究结果：

Enrichment and purification of PEDV virions

通过超速离心和蔗糖密度梯度离心成功获得高纯度病毒颗粒，病毒滴度测定显示20%~40%蔗糖密度区间病毒浓度最高。SDS-PAGE和Western blot验证显示病毒结构蛋白完整性良好，S蛋白条带清晰可见。

Generation and identification of mAbs against the PEDV S protein

获得7株抗S蛋白单克隆抗体(1F11、2C4、3D11、3G7、4G5、8B2、8E4)。免疫荧光检测显示所有mAb均能与PEDV感染细胞结合，但仅4G5单抗在Western blot中识别线性表位，其余6株均识别构象表位。

Mapping the location of epitopes targeted by mAbs on the S protein

通过系列截短蛋白表达发现，4G5单抗识别S2'e区域(1200-1386氨基酸)。进一步精细定位显示该单抗特异性识别1273^NATYLNLTGE1282线性表位。丙氨酸扫描突变证实N1273-A1274-T1275-Y1276-L1277和N1278-L1279-T1280-G1281-E1282为关键氨基酸残基。

Conservation analysis of the identified epitopes

对G1a、G1b、G2a、G2b、G2c等不同基因型PEDV毒株的S蛋白序列分析显示，1273^NATYLNLTGE1282表位在全部测试毒株中完全保守，未发生任何氨基酸突变。

Specificity and spatial structure

AlphaFold结构预测显示该表位暴露于S蛋白C端表面，空间可及性良好。交叉反应性实验证实4G5单抗能与8种不同亚型PEDV毒株发生反应，显示广谱识别能力。

研究结论表明，1273^NATYLNLTGE1282是PEDV S蛋白中首个被精确定位的S2亚基线性B细胞表位，其高度保守特性突破了现有疫苗针对变异毒株保护力不足的瓶颈。该发现为开发广谱PEDV血清学诊断试剂提供了新靶点，同时为设计覆盖多种基因型的通用型疫苗奠定了分子基础。特别值得注意的是，与传统集中于S1亚基的表位研究相比，针对S2亚基保守表位的探索为应对病毒抗原漂移提供了新思路，对其他冠状病毒的疫苗研发也具有重要借鉴意义。