PD-L1调控c-MET磷酸化介导EGFR突变非小细胞肺癌奥希替尼耐药的机制研究

本研究针对EGFR突变非小细胞肺癌(NSCLC)中PD-L1表达与奥希替尼耐药的关系展开深入探索。研究人员通过体外实验发现PD-L1过表达可上调c-MET磷酸化水平，并通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性实现这一调控。动物实验证实PD-L1过表达细胞在奥希替尼治疗过程中更易发生MET扩增。该研究揭示了PD-L1在EGFR-TKI耐药中的新机制，为联合治疗策略提供理论依据。

　　

在肺癌研究领域，表皮生长因子受体(EGFR)突变型非小细胞肺癌(NSCLC)的靶向治疗一直是关注焦点。尽管第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)奥希替尼(osi-mertinib)显著改善了患者预后，但耐药问题仍然困扰着临床实践。值得注意的是，MET原癌基因扩增成为奥希替尼耐药的主要机制之一，约15-20%的患者会出现这种情况。

与此同时，程序性死亡配体1(PD-L1)作为免疫检查点分子，在肿瘤免疫逃逸中发挥关键作用。然而，近年来研究发现PD-L1可能还具有直接的信号传导功能，参与治疗耐药性的发展。特别是在EGFR突变NSCLC中，PD-L1表达与EGFR-TKI疗效的关系存在争议，其潜在机制亟待阐明。

在这项发表于《Journal of Biomedical Science》的研究中，Chia-Chi Hsu和Derek De-Rui Huang等研究者深入探讨了PD-L1在EGFR突变NSCLC中的非免疫学功能，特别是其对c-MET信号通路的调控作用及其在奥希替尼耐药中的意义。

研究采用的主要技术方法包括：通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建PD-L1敲除细胞系，利用质粒转染建立PD-L1过表达稳定株；采用人类受体酪氨酸激酶(RTK)阵列筛选磷酸化变化；通过蛋白质印迹法(Western blot)验证蛋白表达和磷酸化水平；使用蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性测定试剂盒评估酶活性；利用siRNA文库进行PTP家族成员筛选；通过RNA测序分析基因表达谱；建立异种移植小鼠模型进行体内药效评价；采用TaqMan探针法检测MET基因拷贝数变异(CNV)。

PD-L1诱导人EGFR突变NSCLC细胞中c-MET磷酸化

研究人员首先在NCI-H1975细胞(EGFR L858R/T790M突变)中建立了PD-L1稳定过表达细胞系。通过人类受体酪氨酸激酶(RTK)阵列分析发现，与对照细胞相比，PD-L1过表达细胞中c-MET磷酸化水平显著增加。这一现象即使在血清饥饿条件下仍然存在。

为进一步验证PD-L1对内源性c-MET磷酸化的影响，研究团队使用干扰素-γ(IFNγ)刺激NCI-H1975和NCI-H1650(EGFR外显子19缺失E746-A750)细胞。结果显示，随着PD-L1表达的诱导，c-MET磷酸化水平也相应增加。相反，当使用CRISPR技术敲除PD-L1后，c-MET磷酸化水平显著降低，这一结果在siRNA敲低实验中得到了进一步证实。

PD-L1通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性上调c-MET磷酸化

为了阐明PD-L1调控c-MET磷酸化的机制，研究者提出了两种假设：一是PD-L1缺失导致肝细胞生长因子(HGF)表达下调；二是PD-L1缺失增强了PTP活性，从而促进c-MET去磷酸化。

通过分析EMBL-EBI表达图谱数据库，研究发现EGFR突变细胞中HGF基础表达极低，且PD-L1过表达或敲除并不显著改变分泌型HGF蛋白水平。相反，当使用PTP抑制剂钒酸钠(Na₃VO₄)处理多种EGFR突变NSCLC细胞系时，c-MET基础磷酸化水平显著增加，证实PTP是c-MET磷酸化的关键调节因子。

酶动力学实验直接评估了PTP活性，结果显示在NCI-H1975 PD-L1过表达细胞中，PTP活性降低；而在PD-L1敲除细胞中，PTP活性增加。更重要的是，通过时间进程和剂量依赖性实验证明，PTP活性的抑制可以恢复PD-L1敲除细胞中下调的c-MET磷酸化水平。

多个PTP参与PD-L1依赖的c-MET磷酸化调控

人类PTP家族包含多种调控蛋白酪氨酸磷酸化的成员。为确定每个PTP家族成员在PD-L1敲除EGFR突变NSCLC细胞中调控c-MET磷酸化的作用，研究使用定制siRNA文库分别敲低每个PTP的表达。

在36个PTP中，有10个PTP的siRNA敲低能够部分恢复c-MET磷酸化，包括DUSP7、DUSP10、DUSP16、PTEN、PTPN2、PTPN12、PTPRK、PTPRR、PTPRS和PTPRU。通过RNA测序比较亲代NCI-H1975和PD-L1过表达细胞中这10个PTP的mRNA表达，发现DUSP10、DUSP16、PTPN12和PTPRR的mRNA表达在PD-L1过表达细胞中显著降低。

这些结果表明，PD-L1通过与PTP家族多个成员而非单一特定PTP相关联，来调控EGFR突变NSCLC细胞中的c-MET磷酸化。

PD-L1过表达且c-MET磷酸化增加的EGFR突变NSCLC细胞易发生MET依赖性奥希替尼获得性耐药

了解PD-L1可通过抑制PTP上调c-MET磷酸化后，研究者进一步探索了PD-L1过表达和c-MET磷酸化在EGFR-TKI耐药中的作用。初步评估显示，NCI-H1975亲代细胞和PD-L1过表达细胞对奥希替尼的敏感性和MET基因拷贝数变异(CNV)在基线时无显著差异。

为评估PD-L1过表达对奥希替尼耐药的影响，研究建立了异种移植小鼠模型。将NCI-H1975亲代细胞、PD-L1敲除细胞和PD-L1过表达细胞皮下接种，并通过口服给药给予奥希替尼治疗，直至发生奥希替尼耐药。

结果显示，NCI-H1975 PD-L1过表达组的无进展生存期显著短于亲代和PD-L1敲除组。在奥希替尼耐药时收获肿瘤，发现NCI-H1975 PD-L1过表达组的MET CNV较基线显著增加，而亲代和PD-L1敲除组则无此变化。这些体内结果表明，PD-L1过表达改变了耐药模式，并使肿瘤细胞在奥希替尼治疗下更容易发生获得性MET扩增。

研究结论与意义

本研究提供了强有力的证据，表明PD-L1通过抑制PTP活性，导致人EGFR突变NSCLC细胞中c-MET磷酸化上调。更重要的是，研究发现具有PD-L1过表达的EGFR突变NSCLC细胞在奥希替尼治疗下容易获得MET扩增。这些发现展示了免疫检查点PD-L1如何非常规地作为c-MET磷酸化的调节因子，在EGFR突变NSCLC的奥希替尼治疗期间促进MET依赖性耐药的发展。

该研究首次在机制上证明了PD-L1可以调控EGFR突变NSCLC细胞系中的c-MET，且这种调控是通过与PTP的细胞内关联实现的。研究结果表明，PD-L1不仅与一个PTP而且与广泛的PTP酶组相关联来调节c-MET磷酸化，这表明在c-MET去磷酸化过程中存在冗余性，并指出了EGFR突变NSCLC细胞中PTP之间存在潜在补偿机制。

从临床角度看，MET扩增是奥希替尼治疗最常见的耐药机制，可通过联合使用tepotinib或capmatinib等c-MET抑制剂有效靶向。本研究提供的临床前证据表明，PD-L1可能是一个候选预测生物标志物，用于识别有获得MET扩增风险的患者群体，这些患者可能因此从前线c-MET抑制中获益更多。

该研究扩展了我们对PD-L1在EGFR突变NSCLC中功能的理解，超越了其作为免疫检查点的角色，揭示了PD-L1在影响肿瘤进化模式和靶向治疗耐药性中的肿瘤内在作用，为未来联合治疗策略的开发提供了重要的理论基础。