PB-DiffHiC：基于伪大样本Hi-C数据的高分辨率染色质差异互作统计检测新方法

为解决单细胞Hi-C（scHi-C）数据高分辨率下稀疏性导致的染色质差异互作检测难题，研究人员开发了PB-DiffHiC统计框架。该研究通过高斯卷积平滑与泊松模型整合归一化与假设检验，在10 Kb分辨率下显著提升检测精度与可靠性。实验验证显示其与批量Hi-C数据一致性更高，为三维基因组动态研究提供了稳健的计算工具。

　　

在基因组三维结构研究领域，高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术的出现革命性地揭示了染色质在细胞核内的空间组织方式。特别是单细胞Hi-C（scHi-C）技术的发展，使科学家能够在单个细胞水平观察染色质互作，为理解细胞异质性和发育动态提供了前所未有的视角。然而，scHi-C数据固有的稀疏性、低基因组覆盖度和高度异质性，使得在高分辨率（如10 Kb）下检测不同生物学条件间的差异染色质互作仍然面临巨大挑战。这种高分辨率对于识别基因与远端调控元件之间的功能互作至关重要，而现有方法往往无法有效处理伪大样本（pseudo-bulk）Hi-C数据在高分辨率下的极端稀疏性问题。

传统的解决方案主要依赖两类策略：一是对单细胞数据进行插补处理，但这种方法计算量大且缺乏验证；二是将单个细胞的数据聚合为伪大样本矩阵后应用常规批量Hi-C分析工具，但高分辨率下的数据稀疏性限制了这些方法的有效性。现有批量Hi-C差异分析方法如HOMER、diffHiC和multiHiCcompare等，基于RNA-seq设计的统计框架（如edgeR和DESeq2），需要深度测序数据和多个生物学重复，而新近发展的FIND、Selfish和HiC-DC+等方法虽然考虑了空间依赖性或距离感知归一化，但仍针对批量数据优化，未能充分适应伪大样本数据在高分辨率下的特性。

为了直接应对这一挑战，周燕等研究人员在《BMC Genomics》上发表了题为"PB-DiffHiC: a statistical framework for detecting differential chromatin interactions from high resolution pseudo-bulk Hi-C data"的研究论文，开发了一种创新的统计框架PB-DiffHiC（伪大样本差异Hi-C），能够直接在10 Kb分辨率下分析原始伪大样本Hi-C数据，检测条件间的差异染色质互作。

研究人员通过整合高斯卷积平滑技术、短程互作稳定性假设和泊松建模，开发了一个同时执行归一化和统计检验的优化框架。该方法主要采用两种实验设置：合并重复设置（将同一条件下的所有单细胞数据聚合为一个伪大样本矩阵）和双重复设置（将单细胞随机分为两组生成两个伪矩阵以纳入生物学变异）。关键技术包括对原始接触矩阵进行高斯卷积平滑以增强信号，利用空间邻近互作的依赖性；基于泊松分布的假设检验框架，通过条件二项分布计算P值；以及通过控制短程互作（最多5个bin距离）的错误发现率来估计归一化缩放因子。

研究团队首先使用高覆盖度的scHi-C数据集（94个小鼠胚胎干细胞mESC和188个小鼠神经元祖细胞NPC）进行方法基准测试。结果显示，PB-DiffHiC在控制假阳性方面表现优异：在双重复设置下精度比替代方法高1.5倍，在合并重复设置下精度高3倍。虽然FIND和Selfish获得了更高的召回率和F1分数，但这是以牺牲精度为代价的（FIND精度仅24.81%，接近随机猜测）。进一步分析表明，FIND和Selfish对阴性差异互作存在显著性高估问题，而HiC-DC+则低估了阳性互作的显著性。

在伪大样本与匹配批量Hi-C数据的一致性分析中，PB-DiffHiC表现出最强的关联性（Spearman's ρ最高达0.23）和最高的重叠比例（双重复设置78.09%，合并重复设置41.98%），远优于Selfish（4.73%）和HiC-DC+。当考察前10万个最显著差异互作时，PB-DiffHiC的双重复设置 consistently保持约20%的重叠比例，且在不同显著性水平下保持稳定，证明了其在不同阈值下的鲁棒性。

在案例研究中，研究人员重新分析了海马CA1锥体神经元和齿状回（DG）细胞的scHi-C数据，聚焦Kcnq5启动子相关互作。PB-DiffHiC成功识别出20个差异染色质互作（全部在CA1中频率更高），与SnapHiC-D基于单细胞插补方法发现的11个互作高度一致。两组结果都显示Kcnq5启动子与上游基因体区域、Gsta3基因以及下游具有CA1特异性H3K27ac信号的推定增强子区域存在互作。值得注意的是，PB-DiffHiC还发现了SnapHiC-D未检测到的约60 Kb上游的一些差异互作，这些互作与更高的H3K27ac和H3K4me1标记相关，提示可能存在未被认识的增强子-启动子互作参与Kcnq5转录调控。

研究结论表明，PB-DiffHiC是一个统计上合理且稳健的方法，可直接分析原始伪大样本Hi-C数据进行高分辨率差异染色质互作分析，避免了对单细胞插补的依赖。该方法通过高斯卷积缓解稀疏性问题，利用空间依赖性增强信号检测，并通过控制短程互作的错误发现率来估计缩放因子，实现了归一化与假设检验的统一框架。

PB-DiffHiC的重要意义在于它解决了scHi-C数据分析中的关键瓶颈问题，为研究三维基因组组织在不同生物学条件下的动态变化提供了可靠工具。其灵活性支持两种实验设置，适应不同研究需求：双重复设置优先考虑更高的召回率和F1分数，而合并重复设置则实现更高的精度。随着scHi-C技术的不断进步，PB-DiffHiC为在高分辨率下分析差异染色质互作提供了强大的计算框架，将促进对基因组结构-功能关系的深入理解，特别是在发育、疾病和细胞异质性研究领域。

未来的发展方向包括开发数据自适应策略选择高斯卷积的平滑参数，以及探索该方法在真正单细胞水平上的应用，从而实现对单个细胞内染色质互作的更精确洞察。同时，PB-DiffHiC的设计不依赖于物种特异性假设，原则上也适用于人类、植物或无脊椎动物等其他生物的Hi-C数据集，只要具有足够的测序深度和分辨率来构建可靠的伪大样本接触矩阵。