神经网络辅助超低光损伤三光子显微镜实现再生肌生成过程的高保真动态监测

《PhotoniX》：Ultra-low photodamage three-photon microscopy assisted by neural network for monitoring regenerative myogenesis

本研究针对三光子显微镜(3PM)在活体成像中因高功率激光和长扫描时间导致的光损伤问题，开发了多尺度注意力去噪网络(MSAD-Net)，实现了在1/4-1/2激发功率和1/6-1/4扫描时间条件下仍能保持优异图像质量(SSIM=0.9932)。该技术成功应用于小鼠骨骼肌再生过程的五通道深度成像，揭示了肌肉干细胞(MuSCs)、巨噬细胞和血管微循环在再生过程中的动态相互作用，为研究高散射组织中脆弱生物过程提供了新方法。

　　

在生物医学研究领域，活体深层组织的高分辨率成像一直是科学家们追求的目标。骨骼肌作为人体重要的运动器官，具有显著的再生能力，但在肌肉疾病如肌少症和杜氏肌营养不良等情况下，这一过程会受到影响。肌肉再生主要由肌肉干细胞(MuSCs)介导，这些细胞与微环境中的多种细胞类型存在复杂相互作用。然而，由于缺乏准确的三维可视化技术，研究人员难以全面观察再生过程中的细胞事件和动力学行为。

传统双光子显微镜(2PM)在成像深度和轴向分辨率方面存在局限，而新兴的三光子显微镜(3PM)虽然能提供更深的穿透能力和更好的光学限制，但其使用的高峰值功率激光带来了严重的光损伤风险。当激光功率超过2.0 mW(1300 nm)或1.5 mW(1550 nm)时，肌肉组织会出现明显的结构损伤，如血管内皮细胞变形和胶原纤维断裂。同时，低重复频率的激光器延长了扫描时间，进一步加剧了光损伤的可能性，限制了3PM在脆弱组织研究中的应用。

为了解决这一关键问题，Li等人开发了多尺度注意力去噪网络(MSAD-Net)，这是一种精确且通用的去噪网络，适用于各种结构和噪声水平。该网络基于改进的UNet架构，结合了Transformer和卷积块注意力模块(CBAM)，能够捕获全局上下文信息并增强模型的判别能力。研究人员设计了结合均方误差(MSE)和多尺度结构相似性指数(MS-SSIM)的混合损失函数，实现了更高的精度。

研究团队首先验证了3PM在小鼠肌肉组织成像中的优势。与2PM相比，3PM在成像深度、信噪比(SBR)和轴向分辨率方面表现更优。例如，在350μm深度处，MuSCs的3PM图像SBR仍保持较高水平，而2PM图像SBR显著降低。轴向分辨率方面，3PM图像中MuSCs的边界框z方向长度约为27μm，明显小于2PM图像的40μm，表明2PM存在z轴拉伸现象。

通过MSAD-Net辅助成像，研究人员实现了在低激发功率(1.0-1.5 mW)和短扫描时间(2-3μs/像素)条件下的高质量成像。该网络对血管内皮细胞、MuSCs和巨噬细胞等多种结构的去噪效果显著，将图像信噪比(SNR)从0.7 dB提升至21.2 dB，同时保持原始生物特征的完整性。与高斯滤波、中值滤波、BM3D等传统方法相比，MSAD-Net在结构相似性指数(SSIM)、峰值信噪比(PSNR)和均方误差(MSE)等指标上均表现最佳。

五通道显微成像揭示肌肉再生时空图谱

研究人员通过MSAD-Net辅助的五通道成像系统，同时观察了巨噬细胞、MuSCs、肌肉血管、肌纤维和纤维膜在肌肉再生过程中的变化。结果显示，在未受伤的胫骨前肌(TA)中，肌纤维排列紧密，MuSCs处于静止状态，巨噬细胞稀少。受伤后，原有肌纤维逐渐分解，血管解体，MuSCs和巨噬细胞激活增殖。特别值得注意的是，巨噬细胞与MuSCs的距离逐渐减小，血管直径增大，这些变化在伤后第3天最为明显，此时MuSCs开始融合形成初始肌纤维。

血管微循环动态跟踪

通过双色三光子荧光显微成像，研究人员观察了血管内皮细胞和血液微循环在再生过程中的动态变化。发现受伤后，血管结构被破坏，直径小于10μm的小血管血流速度增加，部分血管出现微循环障碍。伤后第3天，仅有部分血管显示DCBT NPs信号，表明血管连通性差。伤后第4天，血流速度减慢，大部分血管恢复微循环，同时可以检测到肌纤维的形成。这些发现揭示了血管在肌肉再生中的重要作用。

巨噬细胞三维动态追踪

研究人员还对巨噬细胞进行了连续的三维成像，发现受伤后巨噬细胞迅速增殖并开始运动，其运动轨迹与肌纤维方向的夹角显著增加。根据形态和运动速度，巨噬细胞可分为"响应细胞"和"静止细胞"两种类型。响应细胞主要响应损伤，具有高速运动和球形形态特征；而静止细胞则主要促进肌纤维形成，表现为静止特性。这一发现为理解巨噬细胞在肌肉再生中的功能提供了新视角。

主要技术方法

本研究主要采用三光子显微镜成像技术，结合自主开发的多尺度注意力去噪网络(MSAD-Net)进行图像处理。实验使用BaCl₂诱导的小鼠肌肉损伤模型，通过多波长激发(1300 nm和1550 nm)实现五通道成像，包括三光子荧光成像(巨噬细胞、MuSCs和血管)和二次/三次谐波成像(肌纤维和纤维膜)。图像分析采用Imaris软件进行三维重构和细胞追踪，统计学分析使用GraphPad Prism软件完成。

研究结论与意义

本研究开发的MSAD-Net辅助3PM成像技术，成功解决了三光子显微镜在活体成像中面临的光损伤与成像质量之间的权衡问题。该技术不仅能够显著降低激发功率和扫描时间，还能保持优异的图像质量，实现对脆弱生物样品的长时程观察。通过这一技术，研究人员首次在细胞和组织水平上揭示了肌肉再生过程中MuSCs、巨噬细胞和血管微循环的动态相互作用，为理解肌肉再生机制提供了重要实验证据。

该研究的创新之处在于将深度学习技术与先进成像方法相结合，为研究高散射组织中的生物过程提供了新思路。未来，这种方法有望应用于肾脏、肝脏等其他脆弱器官的研究，帮助科学家揭示更多光敏感和复杂的生物过程，如急慢性损伤期间的快速动力学和相互作用。此外，各种深度学习方法的应用将进一步推动3PM向更快、更深、更大视野的成像方向发展，为生物医学研究开辟新的可能性。

这项研究不仅深化了我们对肌肉再生机制的理解，也为活体深层组织成像技术的发展指明了新方向，标志着计算光学成像与生物医学研究的深度融合进入新阶段。