利用激素自养与驯化培养技术提升Kinnow柑橘体细胞胚发生的稳定性、同步性及降低体细胞无性系变异

本研究针对Kinnow柑橘（Kinnow mandarin）在性状特异性品种改良中需提升体细胞胚发生（somatic embryogenesis）技术的胚胎发生稳定性与遗传保真度问题，通过植物生物调节剂（PBR）自养和驯化介导的再生技术，开发出一套高效再生体系。研究团队利用未干燥完全成熟种子，在特定培养基（含MS基础盐、50.0 g L?1蔗糖、200.0 mg L?1活性炭和2.5 g L?1凝胶）中成功诱导出胚性愈伤组织（21.33%），并通过去除活性炭及两次20天间隔继代培养实现高效驯化。激活后的愈伤组织在液体悬浮系统（MS + 50.0 g L?1蔗糖）中实现同步体细胞胚发生（92.00%，20.81天）。体细胞胚成熟与萌发虽耗时较长（108.97天），但萌发率高达88.67%，成苗与驯化率分别为87.00%和73.00%。组织学分析显示胚为单细胞起源，ISSR标记可鉴别体细胞无性系变异，表明该体系适用于随机及定点诱变（包括基因组编辑）研究，为柑橘遗传改良提供了有力工具。

　　

为推进性状特异性品种改良，研究人员聚焦于提升Kinnow柑橘（Kinnow mandarin）体细胞胚发生（somatic embryogenesis）体系在胚胎发生稳定性与遗传保真度方面的表现。他们采用植物生物调节剂（plant bio-regulator, PBR）自养和驯化（habituation）介导的再生策略展开研究。

实验发现，使用未干燥的完全成熟种子（于合点端进行垂直切割后接种），在转化为干燥阶段的过程中，能在特定培养基上诱导外珠被产生胚性愈伤组织（embryogenic callus），诱导率达21.33%。该培养基包含Murashige and Skoog（MS）基础盐、50.0 g L^?1蔗糖、200.0 mg L^?1活性炭（activated charcoal）以及2.5 g L^?1凝胶（gelrite）。

进一步的高效驯化发生在无活性炭的相同培养基中；愈伤组织经两次频繁继代培养（间隔20天），先后在含与不含活性炭的培养基上完成“激活”。随后将这些激活愈伤组织转移至液体悬浮系统（MS + 50.0 g L^?1蔗糖）中，在第二次继代后的20.81天内实现了高度同步的体细胞胚发生（92.00%）。

尽管体细胞胚（somatic embryos）的成熟与萌发过程耗时较长（108.97天），但萌发率接近88.67%。在液体纸桥系统与特定盆栽基质P₁（椰糠:蛭石:珍珠岩，体积比2:1:1）中，成苗率与驯化适应率分别达到87.00%和73.00%。

组织学与显微观察揭示，体细胞胚起源于单细胞，且在第二次继代后7天出现高频率的细胞质单胚性细胞。基于简单重复序列间区（inter simple sequence repeat, ISSR）的遗传保真度测试成功鉴别出可区分体细胞无性系变异（somaclonal variation）的分子标记。

因此，这一高频再生系统可成为利用随机（物理与化学）及位点特异性（基因组编辑）诱变技术诱导突变的有力工具。