靶向TNF-α与IL-6R的新型双特异性抗体：炎症治疗领域的突破性免疫治疗剂

本期推荐一项针对类风湿关节炎治疗难题的创新研究。为解决单一靶点生物制剂30%无响应率的临床困境，研究团队设计了一种同时靶向TNF-α和IL-6R的双特异性抗体（BisAb）。通过计算机辅助设计与分子对接技术优化结构，并在大肠杆菌中成功表达。实验证实该双抗能高效中和TNF-α介导的细胞毒性（EC50=16.48 nM），抑制STAT3磷酸化通路，其亲和力（Kaff≈10-12-10-13 M）与亲本单抗相当。这项研究为炎症性疾病提供了新型双靶点治疗策略。

　　

在自身免疫疾病治疗领域，类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）始终是困扰全球医患的重大挑战。这种慢性炎症性疾病导致关节畸形和骨结构破坏，全球约1%人口受其影响，且女性患病率是男性的2-3倍。尽管肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）等关键炎症因子已被证实是RA治疗的重要靶点，但临床使用的单克隆抗体（如阿达木单抗Adalimumab和托珠单抗Tocilizumab）仍有30-40%患者响应不佳。这种治疗困境促使科学家探索能同时阻断多重炎症通路的新型疗法——双特异性抗体（Bispecific Antibody, BisAb）由此成为研究热点。

为突破单一靶点治疗的局限性，来自伊朗巴斯德研究所的Mansooreh Heravi团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》发表了创新性研究。他们基于临床已批准的阿达木单抗（抗TNF-α）和托珠单抗（抗IL-6R）的互补决定区（CDRs），通过计算生物学与实验验证相结合的策略，成功开发出一种能同时靶向TNF-α和IL-6R的最小化双特异性抗体分子。

研究主要采用以下关键技术方法：1) 通过Alphafold2人工智能预测与分子对接技术优化抗体结构；2) 利用表面响应法（RSM）优化大肠杆菌表达条件；3) 采用镍柱亲和色谱纯化包涵体蛋白；4) 通过Beatty法ELISA测定抗体亲和力（K_aff）；5) 借助L929细胞MTT法评估TNF-α中和活性；6) 使用THP1细胞Western blot分析STAT3磷酸化抑制效应。

设计蛋白模型的理性构建

研究人员设计了8种不同构型的双特异性抗体（图示Code#1-#8），系统考察了组氨酸标签位置、肽连接子类型（(G4S)3或(G2S)4）以及轻重链可变区（VH/VL）排列顺序的影响。二级结构分析显示这些参数未引起显著结构变化，而Alphafold2预测证实所有模型均能保持与亲本抗体Fab区相似的正确折叠。

计算生物学验证结构可靠性

通过Ramachandran图分析（核心区占比>90%）、ERRAT值（≈95%）和Verify3D评分（>80%）证实模型的高质量。Molprobity评分显示Code#1和#3模型质量最佳，而Aggrescan3D分析表明Code#1具有最低聚集倾向，因此被选为后续实验构建对象。

分子对接揭示高效结合机制

HADDOCK分子对接显示Code#1、2、8模型与TNF-α和IL-6R具有最高结合亲和力（表2）。Code#1与TNF-α的结合解离常数（K_D）为3×10^-9 M，与IL-6R为2.5×10^-9 M，显著优于其他设计变体。

分子动力学模拟证实结合稳定性

100 ns分子动力学模拟显示，Code#1与双靶点的复合物结构稳定：RMSD值稳定在0.73 nm，回转半径（Rg）从4.5 nm降至3.5 nm表明结构松弛化（图3A-B）。RMSF分析显示除非结合区（IL-6R 25-80aa）外，氨基酸波动范围仅0.1-0.2 nm（图3C）。MM/GBSA计算结合自由能达-60 kcal/mol，其中静电相互作用为主要贡献力。

大肠杆菌系统高效表达

通过RSM优化确定最佳表达条件（37°C、1 mM IPTG诱导2小时），SDS-PAGE显示约60 kDa目的蛋白成功表达（图4A）。scFv片段（Ada-scFv和Toci-scFv）约30.3 kDa，均以包涵体形式获得（图4B-C）。

高亲和力结合验证

ELISA分析显示：BisAb对TNF-α的亲和常数（K_aff）达7.7×10^-13 M，与其Ada-scFv组分（9.4×10^-13 M）相当，但低于商业化阿达木单抗生物类似药（7.5×10^-15 M）（图5）。对IL-6R的亲和力测定中，BisAb（1.65×10^-12 M）与Toci-scFv（1.87×10^-12 M）表现相近，且优于托珠单抗（7.13×10^-12 M）。

显著中和TNF-α细胞毒性

MTT法显示BisAb能有效保护L929细胞免受TNF-α介导的细胞毒性，其EC₅₀值为16.48 nM，与Ada-scFv（12.27 nM）相当，但高于阿达木单抗（0.6 nM）（图6）。表明单臂结合虽降低中和效率，仍保持显著生物活性。

有效抑制IL-6信号通路

Western blot分析显示：BisAb（20-80 μg/mL）预处理的THP1细胞在IL-6刺激后，STAT3磷酸化水平显著降低（图8）。未处理细胞的pSTAT3/STAT3比值最低，而IL-6单独刺激组比值最高。双特异性抗体处理组的磷酸化抑制效果与托珠单抗生物类似药相当，证实其有效阻断IL-6R信号传导。

本研究成功证明了一种新型双特异性抗体的治疗潜力。该分子通过理性设计保留了两个亲本抗体的结合特性，能同时中和TNF-α的细胞毒作用和抑制IL-6介导的STAT3信号通路。其创新性体现在：1) 采用最小化设计（scFv二聚体）降低免疫原性；2) 借助计算生物学大幅提高研发效率；3) 实现大肠杆菌表达体系生产复杂双特异性分子。

值得注意的是，虽然双抗分子对单个靶点的亲和力略低于完整单抗，但其同时靶向双重通路的特点可能产生协同治疗效应。这种协同作用在RA等复杂疾病中尤为重要，因为TNF-α和IL-6在炎症网络中存在交叉对话（crosstalk）。

该研究的临床意义在于：为对现有生物制剂响应不佳的患者提供了新治疗选择；通过双靶点抑制可能降低耐药性发生；大肠杆菌表达系统显著降低生产成本。未来研究需进一步验证其在动物模型中的疗效及药代动力学特性，并探索其在外周血单个核细胞（PBMCs）等原代细胞中的免疫调节功能。

这项研究不仅为RA治疗提供了新型候选药物，更建立了从计算设计到实验验证的双特异性抗体开发范式，为其他炎症性疾病和感染性疾病的治疗策略开发提供了重要参考。