日行与夜行：卷叶蛾昼夜活动节律下复眼瞳孔动态的温度调控与视觉生态适应机制

本研究针对卷叶蛾科三种近缘蛾类（Grapholita molesta, Lobesia botrana, Cydia pomonella）在不同昼夜活动节律下的视觉适应机制展开研究。通过红外瞳孔测量术、光学显微镜和微CT技术，研究人员发现其叠加型复眼的瞳孔动态受光照、昼夜节律和温度共同调控，且物种间存在显著差异。该研究为理解昆虫视觉系统对环境变化的适应机制提供了新见解，并建立了基于瞳孔动态的高通量环境监测新范式。

　　

在自然界中，动物眼睛需要应对不同栖息地间巨大的光照水平差异，以及每日光照强度、光谱和温度的周期性变化。许多物种的眼睛都与其视觉生态学特征高度匹配，特别是近缘物种在占据不同生态位时，其视觉系统往往存在针对特定视觉环境的微妙适应。其中，最大的选择压力来自于可用光量的昼夜变化。夜行性动物为适应弱光环境演化出了多种机制：包括通过眼睛光学结构增强光灵敏度、光谱灵敏度调节以及能够进行光感受器信号整合的神经网络。值得注意的是，夜行活动通常还与较低的体温相关联，这会减慢包括视觉相关过程在内的生理活动。

在昆虫中，较大的蛾类演化出了有限的恒温性以应对低温，但在像卷叶蛾科（Tortricidae）这样的小型蛾类中，由于其较大的表面积体积比导致热损失不利，尚未发现恒温性描述。有趣的是，在本研究涉及的物种中，夜行性和昼行性活动分别与最大和最小的体型相关联。研究人员假设，为耐受低温，卷叶蛾演化出了在低温下仍能保持更快速度和更高效率的运动蛋白和酶类。为揭示这些适应机制，研究者选择了卷叶蛾科中三种亲缘关系密切但活动时间各异的蛾类：昼行性的梨小食心虫（Grapholita molesta, GM）、黄昏活动的欧洲葡萄蔓蛾（Lobesia botrana, LB）和夜行性的苹果蠹蛾（Cydia pomonella, CP），以研究其瞳孔反射。

昆虫的复眼由称为小眼（ommatidia）的离散单元组成。大多数昆虫具有联立型复眼（apposition compound eyes），其各个小眼在光学上是隔离的。这类眼睛通常光灵敏度较低，一般适应于昼间视觉。然而，一些物种（如某些夜行性蜜蜂）演化出了允许在弱光条件下视觉的适应机制。通常，夜行性昆虫具有叠加型复眼（superposition compound eyes），其折光组件和光敏的光感受器细胞（感杆束）被一个称为“透明带”（clear zone）的半透明间隙隔开。在叠加型眼中，每个感杆束接收来自许多相邻小眼面的光线，从而显著提高了光灵敏度，足以在弱光下实现视觉。光量通过一个强大的瞳孔机制进行控制，该机制由位于特殊色素细胞中的深色色素颗粒产生，这些颗粒吸收叠加的光线。

在具有所谓“纵向瞳孔”（longitudinal pupil）的叠加型眼中，次级色素细胞中的瞳孔色素在透明带的两个极端位置（远端和近端）之间迁移。这种机制存在于许多蛾类中。在具有“晶锥瞳孔”（cone pupil）的眼睛中，初级色素细胞中的色素仅围绕晶锥尖端迁移。最后，一种称为“双色素迁移”（dual pigment migration）的混合机制，由在初级和次级色素细胞中迁移的色素颗粒介导，常见于小型夜行性蛾类。卷叶蛾具有叠加光学和纵向瞳孔的复眼。叠加眼中的瞳孔动力学应取决于移动色素颗粒的运动蛋白的速度以及透明带的厚度；原则上，较小的眼睛可能适应得更快。在不同温度下，瞳孔速度还将受到介导颗粒迁移的分子装置的热适应性的影响。

叠加瞳孔比昼行性昆虫联立眼中的瞳孔慢得多，这意味着蛾类天生适应突然光强变化的能力较差。为了更好地在活动期间应对，叠加瞳孔可能通过前馈机制进行预设，由内在的昼夜节律驱动，并通过急性光适应的反馈机制进行微调。因此，夜行性和晨昏性物种的适应状态可能提前由昼夜节律和昼夜可预测的温度梯度之间的相互作用设定，而昼行性物种在变化较小的温度和光照条件下活动，应更多地依赖于对当前平均光量的适应。

在叠加眼中，未被光感受器细胞吸收的入射光从位于视网膜底部的气管层反射镜（tracheolar tapetum）反射，并从感杆层散射回折光装置。在暗适应眼中，观察者可以看到这种反射为眼睛中央的一个明亮圆斑，即所谓的叠加瞳孔（在解剖上不等同于人眼瞳孔）。瞳孔亮度随着光适应而减弱，可用作评估叠加眼中光适应动力学的代理指标。近红外（NIR）光允许在不触发光转导的情况下监测瞳孔直径，因为它被反射镜反射并被屏蔽色素颗粒部分阻挡。反射强度指示了色素与感杆的距离，从而反映了瞳孔的开放程度。

本研究比较了分别在白昼、黄昏和夜间活动的三种卷叶蛾：梨小食心虫（GM）、欧洲葡萄蔓蛾（LB）和苹果蠹蛾（CP）。先前研究发现这些物种在光谱灵敏度和闪烁融合频率上没有差异。接下来，为了揭示其视觉系统对不同生态位的任何推定的物种特异性适应，研究人员通过观察瞳孔动力学来研究光适应。使用USB显微镜和NIR照明在两种不同温度下监测了内在和诱发的瞳孔动力学，以模拟昼夜条件。为了解释物种间的任何差异，研究人员使用光学显微镜和微CT成像测量了眼睛大小和透明带厚度。假设瞳孔响应时间主要是眼睛直径和温度的函数，并通过对不同大小和眼大小的三个系统发育相关物种在不同温度下进行测试来验证这一主张。

研究人员通过几种光学方法观察了眼睛的形态学方面。计算机断层扫描（CT-scan）用于描述小眼数量和小眼宽度、小眼间角、眼半径、眼宽度和透明带长度。亮场显微镜检查提供了比CT扫描更精细的结构细节和更好的透明带长度估计。最后，用立体显微镜获得了每个物种10个个体的眼宽外部测量值。瞳孔动力学方面，当用外部光源照明时，昆虫眼睛反射的光量作为瞳孔直径的代理指标。使用数字相机捕获瞳孔图像时间序列，并通过图像分析软件进行量化。

为在主观暗期进行实验，将蛾类驯化到12:12小时光暗光周期下，然后在完全黑暗中进行36小时瞳孔监测。正如预期，瞳孔表现出强大的内在节律，并每12小时在开放和关闭状态之间自发切换长达48小时。除了观察到的昼夜节律外，最小的GM的瞳孔随着时间的推移逐渐且不可逆地关闭，中等大小的LB程度较小，可能是由于小型标本的恶化。进一步的实验在主观夜间进行。

在12:12小时光暗训练个体的暗期，用紫外光诱导瞳孔关闭15分钟，随后通过关闭紫外光监测瞳孔开放，直到瞳孔完全开放。平均诱导瞳孔关闭和开放曲线按温度显示。个体曲线被拟合到对数逻辑模型。对于瞳孔关闭曲线，平均拟合优度为R2=0.96±0.03，范围在0.87到0.99之间；对于瞳孔开放曲线，平均拟合优度为R2=0.98±0.02，范围在0.90到0.99之间，表明模型拟合良好。

诱导瞳孔开放曲线在紫外光关闭后立即开始，在记录开始时有一个短暂的5-15分钟“凸起”，对应于眼睛亮度的突然增加，然后迅速下降到最低点，之后以S形方式逐渐增加到约90分钟时的最高点。在内在节律记录中没有观察到这种现象，因此它很可能由先前的紫外光曝光引起。初始瞬变被排除在分析之外，瞳孔开放通过提取曲线S形上升部分的参数进一步量化，该部分开始在瞳孔处于最低亮度时，紧接在“凸起”之后。

对这些曲线的估计斜率（b）和半开放值（t??）的统计分析揭示了显著的物种、性别和温度效应。LB无论温度如何，其瞳孔关闭速度（即较低的t??）都比其他两个物种快，但关闭斜率与CP相似。另一方面，GM具有最高的关闭斜率b（尽管与CP无显著差异），但也具有最高的t??，这意味着其瞳孔需要更长时间才能显著关闭，但关闭速度随时间更恒定，使其在低温下最慢，在较高温度下几乎与CP一样慢。较高温度显著缩短了半关闭时间。关于瞳孔开放，在斜率或半开放时间上没有观察到物种间的差异，但雌性比雄性显著更早达到半开放时间，较高温度显著缩短了半开放时间。

研究发现，三种不同大小的卷叶蛾的瞳孔动力学存在显著差异。此外，温度对每个物种的瞳孔动力学影响不同。这些小型微鳞翅目昆虫的眼大小，按眼半径r估算，接近（LB和CP为230和290μm）或低于（GM为190μm）功能性光学叠加昆虫眼的理论最小尺寸（r>250μm）。尽管计算了下限，但即使在最小的物种GM中，叠加瞳孔也能清晰分辨，表明需要进一步的理论和实验工作来完全理解光学叠加眼。所有三个物种都具有功能性的叠加光学，但由于瞳孔孔径随着眼尺寸减小而减小，具有最小叠加孔径的物种应具有最低的光灵敏度。

性别在眼大小上的差异虽然统计上显著，但很小（小于ANOVA模型总方差的0.5%），并且仅略微导致性别间瞳孔动力学的差异（雌性比雄性眼小，比雄性更早达到半开放时间）。瞳孔动力学由三种卷叶蛾的内在昼夜节律控制。CP眼中色素的昼夜节律性先前已被证明，但其他两个物种中未发现。许多昆虫在恒定光照条件下保持色素位置的每日节律，但在一些物种中，如Pyralid蛾Ephestia kuehniella，没有昼夜节律。甲虫Tenebrio mollitor和床虱Triatoma infestans在恒定黑暗或光照条件下也显示色素迁移的昼夜节律。外部温度不影响T. infestans的屏蔽色素运动，而在CP中，超过阈值温度会诱导色素快速迁移到光适应位置，而不管外部光照条件如何。这表明在一些物种中，温度可能是触发瞳孔动力学的重要因素，由于昼夜间的温度差异，生物体可能利用它来间接估计通常与特定温度范围相关的光照条件。

昼夜节律观察显示，在恒定光照条件下，卷叶蛾物种的开放和关闭具有相似的持续时间。诱导瞳孔关闭明显短于诱导瞳孔开放，而在恒定黑暗中维持的昆虫中，这两个时期的持续时间相似。瞳孔关闭的位置和速度仅取决于绝对光照水平，在黎明和黄昏产生相似的运动曲线。然而，其他研究报告了明显更快的关闭曲线 compared to开放曲线。这些差异可能源于高度可变的实验条件，因为每项研究使用了具有 substantially 不同波长和强度的刺激光——后者通常相差几个数量级。

因此，强烈的光刺激可能加速关闭过程以防止光感受器饱和并保护昆虫免受暂时性失明。或者，观察到的不对称性可能源于实验中光照的突然和人为强烈变化，或由于使用单色紫外光进行刺激，可能导致微绒毛膜降解，或长寿命光产物（如变视紫红质异构体）的积累，可能触发瞳孔关闭直到酶降解。研究人员故意使用集成的环形照明器LED进行监测和刺激，以证明商用级USB显微镜的适用性，并保持设置小巧，以便可以放置在气候化培养箱中。所选刺激波长与所有光感受器类别的灵敏度充分重叠，这在卷叶蛾科中是预期的。因此，研究表明一个简单的现成设备可用于未来研究监测环境污染物对具有叠加眼的昆虫的影响。然而，为了正确测量瞳孔作用光谱，需要具有分光器的落射照明光路。

为了研究瞳孔关闭动力学的种间差异，研究人员比较了三种研究物种用紫外光诱导瞳孔关闭的时间响应曲线。所有曲线在关闭过程开始前都有一个短暂的2-4秒初始延迟。在LB和CP中，随后是瞳孔亮度的快速下降，并逐渐减速。相反，GM在整个关闭期间显示更逐渐和均匀的减少。LB和CP显示双峰模式——一个拐点或平台——在较低温度下变得更加明显。类似的曲线形状在蛾Manduca sexta中有描述，但没有考虑温度或提供机制解释。Pyralid蛾Amyelois transitella描述了三相反射响应，包括由于光感受器色素迁移导致的初始轻微下降、由感杆远端尖端色素聚集引起的瞬时增加，以及随着光感受器和辅助色素细胞色素积累的最终持续下降。后来报道称，夜蛾科仅表现出第二和第三阶段。在本数据中，关闭曲线似乎直接从第三阶段开始，没有检测到前两个阶段的证据。因此，假设在小型叠加眼中，光适应的不同阶段在时间上重叠，没有进一步的实验操作无法分离。

本研究中，LB具有最快的关闭速度（最低的t??）。然而，GM具有最陡的斜率（b），反映了其稳定、类似线性的关闭。LB和CP中较低的b值可能源于曲线中段的拐点，降低了整体陡度。LB中观察到的快速动力学与其生态环境一致，因为它在环境光突然变化的时期活动。这样的条件可能有利于快速的瞳孔调整以保持视觉性能。相反，GM——尽管具有最小的眼睛和推定的最短色素迁移路径——显示最慢但最一致的关闭动力学，比其他物种更大程度地保留关闭曲线的形状。研究发现温度延长了所有三个物种的关闭时间；然而，GM表现出最强的温度依赖性，随着温度下降关闭持续时间显著增加。这提出了瞳孔动力学的热敏感性可能取决于形态特征（如眼大小）的可能性。

在“凸起”之后，统计分析显示物种间没有显著差异——与关闭阶段不同，那里存在种间变异。这表明在黑暗中的开放反应不如关闭机制具有物种特异性且微调程度较低，并且也统一被较低温度减慢。观察到的性别影响仍然无法解释。

主要的种间差异在于关闭过程。黄昏物种LB关闭其瞳孔最快，动力学与更大更慢的夜行性CP相似。相反，昼行性和最小物种GM显示不同的关闭动力学和更大的温度敏感性。这可能与其较小的体型相关，这可以增加热损失，或与昼行活动相关，后者提供较少的自然光变化但更高的光子可用性。因此，GM可能依赖替代保护策略，例如较低的视觉灵敏度或具有联立眼的昼行性物种的适应。因此，瞳孔速度与眼大小成反比的假设被推翻。物种间开放曲线的S形部分的相似性可能源于所有都经历了低于其各自瞳孔开放光阈值的下降。然而，实验中的突然光关闭可能掩盖了任何种间阈值差异。

总之，研究结果突出了瞳孔动力学的清晰种间差异，LB表现出最快和最具响应性的关闭，可能反映了对具有快速光波动环境的适应。相反，GM显示最慢和最具热敏感性的响应，具有明显不同的、更均匀的关闭曲线。这些不同的动力学可能与生态位、视觉生态学或眼睛形态的差异有关，表明塑造物种间瞳孔机制的 divergent 进化压力。

研究主要应用了红外瞳孔测量术（infrared pupillometry）结合USB显微镜进行非侵入性瞳孔亮度监测，使用近红外照明观察瞳孔动态而不触发光转导。通过光学显微镜和微计算机断层扫描（micro-CT）技术对复眼形态进行了精细结构分析，包括小眼数量、直径、眼半径及透明带长度等关键参数的测量。利用对数逻辑模型（log-logistic model）对瞳孔开闭动力学曲线进行拟合，提取斜率（b）和半值时间（t??）等量化参数进行统计学比较。样本来源于实验室饲养的卷叶蛾科昆虫（Grapholita molesta, Lobesia botrana, Cydia pomonella），在可控光周期（12:12 L:D）和温度（15°C与22°C）条件下驯化后进行实验。

眼睛形态

所有研究的物种（从最小到最大：GM、LB和CP）都具有叠加瞳孔，在暗适应后可见，分别由大约120、150和400个小眼组成，可以通过USB显微镜和NIR照明在光适应和暗适应状态下观察。为了解释瞳孔动力学，使用光学显微镜分析了眼睛。透明带的厚度为36μm（GM）、60μm（LB）和85μm（CP），这可能表明在暗适应和光适应状态下，屏蔽色素迁移的距离非常不同。假设运动蛋白速度相等，瞳孔响应时间在GM中最短，在CP中最长。微CT图像提供了小眼直径、小眼间角和眼直径。小眼直径在LB和CP中约为20μm，在GM中约为15μm；估计的小眼间角在较小的蛾类（LB和GM）中明显大于CP。最后，小眼数量和眼半径与个体大小相关。此外，在CP和LB中，雄性比雌性拥有更多的小眼。使用立体显微镜对每个物种10只雄性和雌性眼直径的统计比较显示，CP的眼睛明显比LB宽，LB比GM宽。此外，性别有最小但显著的影响，在CP和GM中，雌性背腹方向的眼睛明显比雄性宽。用立体显微镜测量的眼宽与CT扫描测量的眼宽相关，支持了CT扫描结果。

瞳孔动力学

为了在主观暗期进行实验，将蛾类驯化到12:12小时光暗光周期下，然后在完全黑暗中进行36小时瞳孔监测。正如预期，瞳孔表现出强大的内在节律，并每12小时在开放和关闭状态之间自发切换长达48小时。除了观察到的昼夜节律外，最小的GM的瞳孔随着时间的推移逐渐且不可逆地关闭，中等大小的LB程度较小，可能是由于小型标本的恶化。进一步的实验在主观夜间进行。在12:12小时光暗训练个体的暗期，用紫外光诱导瞳孔关闭15分钟，随后通过关闭紫外光监测瞳孔开放，直到瞳孔完全开放。平均诱导瞳孔关闭和开放曲线按温度显示。个体曲线被拟合到对数逻辑模型。诱导瞳孔开放曲线在紫外光关闭后立即开始，在记录开始时有一个短暂的5-15分钟“凸起”，对应于眼睛亮度的突然增加，然后迅速下降到最低点，之后以S形方式逐渐增加到约90分钟时的最高点。在内在节律记录中没有观察到这种现象，因此它很可能由先前的紫外光曝光引起。初始瞬变被排除在分析之外，瞳孔开放通过提取曲线S形上升部分的参数进一步量化。

讨论

研究发现瞳孔动力学在三种不同大小的卷叶蛾中存在显著差异。此外，温度对每个物种的瞳孔动力学影响不同。这些小型微鳞翅目昆虫的眼大小，按眼半径r估算，接近或低于 proposed 功能性光学叠加昆虫眼的理论最小尺寸。尽管计算了下限，但叠加瞳孔即使在最小的物种GM中也能清晰分辨，表明需要进一步的理论和实验工作。所有三个物种都具有功能性的叠加光学，但由于瞳孔孔径随着眼尺寸减小而减小，具有最小叠加孔径的物种应具有最低的光灵敏度。因此，GM可能具有三个物种中最低的灵敏度，这与其昼行性生活一致，而中间和最高的灵敏度可能 expected 在黄昏和夜行性物种LB和CP中。瞳孔动力学由三种卷叶蛾的内在昼夜节律控制。CP眼中色素的昼夜节律性先前已被证明，但其他两个物种中未发现。许多昆虫在恒定光照条件下保持色素位置的每日节律，但在一些物种中没有昼夜节律。其他昆虫也显示色素迁移的昼夜节律。外部温度不影响一些物种的屏蔽色素运动，而在CP中，超过阈值温度会诱导色素快速迁移到光适应位置。这表明在一些物种中，温度可能是触发瞳孔动力学的重要因素。

昼夜节律观察显示，在恒定光照条件下，卷叶蛾物种的开放和关闭具有相似的持续时间。研究发现诱导瞳孔关闭明显短于诱导瞳孔开放，而在恒定黑暗中维持的昆虫中，这两个时期的持续时间相似。其他研究报告了明显更快的关闭曲线，这些差异可能源于高度可变的实验条件。强烈的光刺激可能加速关闭过程以防止光感受器饱和。或者，观察到的不对称性可能源于实验中光照的突然和人为强烈变化，或由于使用单色紫外光进行刺激。研究人员故意使用集成的环形照明器LED进行监测和刺激，以证明商用级USB显微镜的适用性。所选刺激波长与所有光感受器类别的灵敏度充分重叠。因此，研究表明一个简单的现成设备可用于未来研究监测环境污染物对具有叠加眼的昆虫的影响。

为了研究瞳孔关闭动力学的种间差异，研究人员比较了三种研究物种用紫外光诱导瞳孔关闭的时间响应曲线。LB具有最快的关闭速度。GM显示最慢但最一致的关闭动力学。LB中观察到的快速动力学与其生态环境一致。相反，GM显示最慢和最具热敏感性的响应。这提出了瞳孔动力学的热敏感性可能取决于形态特征的可能性。主要的种间差异在于关闭过程。LB表现出最快和最具响应性的关闭。相反，GM显示不同的关闭动力学和更大的温度敏感性。物种间开放曲线的S形部分的相似性可能源于所有都经历了低于其各自瞳孔开放光阈值的下降。

研究结论表明，三种卷叶蛾的瞳孔动力学存在清晰的种间差异，反映了对其不同生态位和视觉环境的适应。LB作为黄昏活动物种，其快速瞳孔关闭与环境中光线的急剧变化相匹配；GM作为昼行物种，其较慢且温度敏感的响应可能与其较小的体型和较高的环境光照水平相关；CP作为夜行物种，其响应介于两者之间。瞳孔动态不仅受光照反馈调节，更受内在昼夜节律和温度的前馈调控，这种多重调控机制确保了昆虫在复杂环境中的视觉功能。该研究建立了利用瞳孔动态作为非侵入性生物标志物监测昆虫对环境变化（如气候变化、光污染）响应的高通量方法，为理解和保护生物多样性提供了新的技术手段和理论基础。论文发表在《Journal of Comparative Physiology A》，强调了比较生理学在揭示生态适应机制中的重要性。