优化C2C12小鼠成肌细胞在明胶水凝胶上的二维体外分化条件：增强肌管成熟与功能的新策略

本研究针对C2C12小鼠成肌细胞体外分化成熟度低、一致性差的问题，系统优化了二维培养条件。研究发现DMEM添加2%马血清和10% Opti-MEM(DMO)培养基配合胰岛素和丙酮酸补充可显著提升肌球蛋白重链(MyHC)和肌钙蛋白(TNNT1/TNNT3)表达，电脉冲刺激(EPS)改善肌节组织。该方案为肌肉疾病建模和药物筛选提供了可靠、经济的标准化方案。

　　

骨骼肌作为人体最大且最具动态性的器官之一，不仅在运动功能中发挥核心作用，还参与全身代谢调节、葡萄糖稳态和产热过程。然而，骨骼肌组织的高度异质性——包含运动神经元、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞类型——使得在体内环境中特异性研究肌细胞功能变得异常困难。因此，建立可靠的体外模型成为研究骨骼肌生物学、疾病机制和药物筛选的关键。

C2C12小鼠成肌细胞系作为最广泛使用的体外模型，能够在适当条件下分化为多核肌管，但不同实验室的分化协议存在显著差异，导致结果可重复性低。传统二维培养还存在肌管成熟度不足、自发收缩时从刚性表面脱落等问题。虽然三维工程肌肉组织提供了更接近生理的模型，但其通量低、技术要求高。超柔性明胶水凝胶的开发为二维培养提供了更接近天然细胞外基质(ECM)的机械环境，显著改善了肌管排列和成熟度。

在这项发表于《Journal of Muscle Research and Cell Motility》的研究中，Veronica Sian和Per Harald Jonson等研究人员系统优化了C2C12细胞在明胶水凝胶上的分化条件，旨在建立一套经济高效、可重复的标准化方案。

研究采用的主要技术方法包括：使用超柔性明胶水凝胶作为培养基质；比较不同培养基组合（基础DMEM、商业PromoCell培养基及各种补充剂）；通过蛋白质印迹(Western blot)分析肌球蛋白重链(MyHC)、肌钙蛋白(TNNT1/TNNT3)等标志物表达；应用电脉冲刺激(EPS)模拟神经输入；利用RNA测序(RNA-seq)和差异剪接分析(MAJIQ v2)全面解析转录组动态变化。

培养基成分优化研究

研究人员首先比较了标准分化培养基(DMEM+2%马血清)添加10% Opti-MEM的DMO配方与商业PromoCell骨骼肌分化培养基(SkMC-DM)。发现虽然SkMC-DM支持早期分化，但长期使用会导致肌管形态恶化。将培养5-7天后切换到PromoCell生长培养基(SkMC-GM)或DMO可显著改善分化效果。DMO配方产生更薄、排列更整齐的肌管，而SkMC-GM则形成更厚但组织较差的肌管。

补充剂效果评估

研究发现胰岛素-转铁蛋白-硒(I)和丙酮酸(P)补充对肌管成熟有显著促进作用。DMO添加胰岛素(DMO+I)或同时添加胰岛素和丙酮酸(DMO+PI)显著提高了肌球蛋白重链(MyHC)、肌钙蛋白(TNNT1/TNNT3)和肌集钙蛋白(CASQ1/2)的表达水平。相反，省略Opti-MEM的基础DMEM分化效果差，仅通过添加胰岛素可部分挽救这一缺陷。

培养基更换频率影响

每日更换培养基被证明是最佳方案，减少更换频率（每2-3天）会显著降低肌球蛋白表达。有趣的是，添加胰岛素和丙酮酸(DMO+PI)可以部分缓解较少更换频率带来的负面影响。

电脉冲刺激效果

尽管电脉冲刺激(EPS)未显著改变肌球蛋白亚型表达水平，但免疫荧光分析显示电刺激显著改善了肌节α-辅肌动蛋白的组织结构，促进了更成熟的肌管形成。

转录组动态变化

RNA测序分析揭示了分化过程中的广泛转录重编程。主成分分析(PCA)显示不同时间点样品明显分离，第0天(成肌细胞)和第16天(成熟肌管)差异最大。差异表达基因分析发现：第3天有4,482个基因差异表达，第7天有6,083个，第16天有7,084个。基因本体(GO)分析显示上调基因富集于肌肉收缩、肌节组织等过程，下调基因则与细胞周期、DNA复制等相关。

选择性剪接分析

研究发现分化过程伴随广泛的转录组重塑，第0天到第3天有6,718个基因发生23,052个选择性剪接事件。早期剪接事件主要影响细胞周期调控、DNA代谢等过程，而后期则转向蛋白质代谢、细胞定位等功能。

研究结论表明，DMO培养基（DMEM+2%马血清+10% Opti-MEM）是一种经济高效且易于实施的分化方案，其效果可通过添加胰岛素和丙酮酸进一步增强。每日培养基更换对获得最佳分化效果至关重要，电脉冲刺激则有助于改善肌节组织结构。该研究不仅强化了肌源性分化的关键原则，还为生产成熟、功能性肌管提供了实用指导，对基础和应用肌肉研究具有重要意义。

该研究的创新之处在于系统评估了多种培养参数的综合影响，提供了详细的时间动态数据，并通过多组学方法（转录组和蛋白组）全面验证了分化效果。建立的优化方案为肌肉疾病建模、药物筛选和基础肌肉生物学研究提供了可靠且可重复的平台，有助于解决不同实验室间结果变异大的问题，推动C2C12模型在肌肉研究中的更广泛应用。