基于pCAMBIA2300的新型重组CRISPR/Cas9载体系统助力植物高效基因组编辑

来自印度的研究人员针对植物CRISPR/Cas9基因组编辑效率低下的问题，开发了基于pCAMBIA2300的重组载体系统pCR。该系统通过密码子优化、UTR修饰和模块化设计，在烟草和马铃薯中成功敲除PDS基因，编辑效率显著提升，为农业性状改良提供了高效技术平台。

　　

研究人员开发了一种基于pCAMBIA2300的新型重组CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9（CRISPR-associated protein 9）载体系统（简称pCR），旨在解决植物基因组编辑效率低下的难题。该系统对Cas9互补DNA（cDNA）进行了多重优化：在N端和C端添加核定位信号（Nuclear Localization Signals）并进行密码子优化；移除内部限制性酶切位点；在5'端引入马铃薯Rubisco小亚基（rbcS）5'非翻译区（UTR）序列，该序列嵌入马铃薯颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）内含子中。重组Cas9基因（rdCas9）由花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子和胭脂碱合成酶（NOS）终止子调控。

单链引导RNA（sgRNA）表达盒包含拟南芥U6启动子、20-21核苷酸（nt）间隔序列、sgRNA支架序列及马铃薯U6 RNA聚合酶III（Pol-III）终止序列。通过AarI或PaqCI酶切可灵活插入特异性间隔序列。该载体采用模块化设计，支持单重或多重sgRNA的一步克隆，并能组合不同启动子/终止子与Cas9/sgRNA元件。

研究团队通过农杆菌（Agrobacterium）介导的转化技术，在烟草（Nicotiana tabacum）和马铃薯（Solanum tuberosum）中成功敲除八氢番茄红素脱饱和酶基因（PDS），验证了该系统的高效编辑能力。该载体系统为植物重要农艺性状改良提供了多功能工具箱。