新型策划苯二氮?Bretazenil的体内外代谢特征研究：肝细胞与肝微粒体模型与尸检样本的比较分析及其代谢标志物鉴定

本刊推荐：为应对高效力、短半衰期策划苯二氮?Bretazenil在非法药物市场涌现导致的临床与法医毒理学检测挑战，研究人员通过计算机模拟预测、体外肝微粒体(pHLM)与肝细胞孵育实验，并结合尸检血液与尿液样本分析，采用UHPLC-HRMS/MS技术系统解析其代谢途径。研究共鉴定26种代谢物，发现吡咯烷环羟基化为主导代谢路径，首次报道苯二氮?类化合物的半胱氨酸结合新通路，并提出羟基-Bretazenil(B14)、还原羟基-Bretazenil(B6)和还原二羟基-Bretazenil(B1)作为关键消费标志物，为中毒案例鉴定与危害防控提供科学依据。

　　

近年来，苯二氮?类药物与阿片类物质的联合滥用导致严重中毒事件频发，已成为全球公共卫生领域的重要挑战。在这一背景下，一种上世纪80年代研发但未上市的新型苯二氮?类药物——Bretazenil（代号Ro-16-6028）悄然现身非法药物市场。作为一种咪唑-四氢吡咯并-1,4-苯二氮?化合物，Bretazenil不仅具有高效力（较地西泮强效十倍）、短消除半衰期（2-4.5小时）的特性，更因其可能被掺入“苯二氮?-阿片合剂”（benzo-dope）中使用，对用药安全构成严重威胁。然而，由于该化合物代谢迅速且人体代谢数据极度缺乏，临床与法医毒理学领域缺乏可靠的生物标志物来检测其使用情况，这为中毒诊断、司法鉴定及公共卫生监测带来了巨大困难。

为破解这一难题，研究团队在《Archives of Toxicology》发表了系统性研究，通过多维度技术策略揭示了Bretazenil的复杂代谢网络。研究人员首先采用计算机辅助预测工具GLORYx进行代谢路径预判，随后建立体外代谢模型——包括 pooled human liver microsomes（pHLM，150名供体混合肝微粒体）和 pooled human hepatocytes（10名供体混合肝肝细胞）孵育实验，并最终与一例尸检血液和尿液样本进行比对验证。关键技术方法包括：基于高分辨质谱(UHPLC-HRMS/MS)的代谢物鉴定技术、软件辅助数据挖掘(Compound Discoverer v.3.1.1.12)、酶解处理(β-葡萄糖醛酸酶水解)以及碎片离子谱解析策略。所有分析均在正负离子模式下进行，以确保代谢物检测的全面性。

代谢物鉴定结果

通过高分辨质谱分析，研究共鉴定出26种Bretazenil代谢物，其中8种来源于肝微粒体孵育，15种见于尸检尿液，11种存在于尸检血液。主要代谢反应包括：

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  羟基化反应：代谢物B14、B15、B16均显示+15.995 u质量偏移，表明单羟基化发生。碎片谱分析揭示羟基化主要发生在吡咯烷环（B14、B16）和叔丁基链（B15）
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  二羟基化与复合反应：代谢物B7、B8、B12（m/z 450.0658）显示双羟基化特征，结合碎片离子m/z 84.0442(C₄H₆NO⁺)证实吡咯烷环修饰主导。B6（m/z 436.0864）则呈现羟基化与还原反应协同模式，推测还原发生于二氮?核心结构的酮基
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  羧基化反应：代谢物B13（m/z 448.05188）质量偏移+29.979 u，碎片谱显示叔丁链羧基化
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  II相结合反应：发现多种葡萄糖醛酸结合物（B5、B10、B11）和硫酸结合物（B9），其中B9在负离子模式下信号增强30%，符合硫酸酯特征

尤为值得注意的是，研究首次在肝细胞和血液样本中鉴定到一种全新的苯二氮?生物转化路径——半胱氨酸结合代谢物B2（m/z 537.0800）。该代谢物呈现+119.0036 u质量偏移，对应羟基化（+15.995 u）与酰基-半胱氨酸残基结合（+C₃H₅NOS，+103.0086 u）的协同反应。虽然未检测到谷胱甘肽或半胱氨酸-甘氨酸结合物，但该发现提示Bretazenil可能通过直接半胱氨酸结合增强亲水性促进排泄，或作为反应性中间体参与毒性应答。

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讨论与结论

本研究通过整合计算机预测、体外模型与真实生物样本分析，首次绘制了Bretazenil在人体中的完整代谢图谱。研究发现：

1. 1.
   代谢主导路径：吡咯烷环羟基化是主要I相代谢途径，而非计算机预测的溴苯环羟基化，这提示现有预测工具对苯二氮?类药物的代谢位点预测仍需优化
2. 2.
   模型相关性：肝细胞模型较肝微粒体能更全面模拟II相代谢（如葡萄糖醛酸结合），但肝微粒体因成本与时效优势仍适用于快速药物监测
3. 3.
   标志物推荐：基于代谢物丰度与检测稳定性，推荐以下代谢物作为Bretazenil消费的关键标志物：
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     血液检测：羟基-Bretazenil(B14)与还原羟基-Bretazenil(B6)
   • •
     尿液检测：B6、B14及还原二羟基-Bretazenil(B1)
4. 4.
   毒理学意义：Bretazenil的广泛代谢提示其可能通过活性代谢物（如B6）延长药理作用，这解释了早期临床研究中观察到的较地西泮更持久的记忆损伤效应。新发现的半胱氨酸结合路径可能涉及毒性中间体形成，需进一步研究其毒理机制

该研究不仅为Bretazen滥用的实验室检测提供了可靠标志物，也为其他策划苯二氮?的代谢研究建立了方法论范式。所发现的代谢物如羟基化衍生物未来可能作为新型精神活性物质（NPS）重现市场，相关监测机构应予以高度关注。研究成果对临床中毒诊断、法医鉴定与公共卫生预警具有重要实践价值。