靶向眼镜蛇毒细胞毒素：基于40T线性单链DNA适配体的抗蛇毒血清展现中和潜力

本研究针对眼镜蛇毒中主要致皮肤坏死成分细胞毒素(CTX)，开发了一种新型40T线性单链DNA适配体。通过改进的离心筛选SELEX技术结合Illumina测序，研究人员成功获得高亲和力（KD=0.33μM）与特异性的适配体，其在体外和实验性中毒模型中显著中和CTX及粗毒引起的细胞毒性，为治疗蛇咬伤皮肤坏死提供了非抗体类生物治疗新策略。

　　

眼镜蛇咬伤导致的局部组织坏死（皮肤坏死）是全球热带地区致残的重要原因，而传统抗体类抗蛇毒血清因细胞毒素(CTX)免疫原性低、结构隐蔽难以靶向，对皮肤坏死的治疗效果有限。CTX作为眼镜蛇毒主要成分（占40-70%），通过其三指环结构介导细胞膜破坏、凋亡和坏死等多重毒性机制。为解决这一难题，研究人员开发了一种新型适配体抗蛇毒血清，直接靶向CTX的功能表位。

研究采用改进的离心式SELEX筛选技术，经过12轮筛选（含1轮负筛选），结合Illumina扩增子测序和生物信息学分析，从随机单链DNA文库中筛选出高亲和力候选序列。关键实验技术包括：SELEX筛选与测序（使用NHS活化琼脂糖树脂固定CTX，Illumina NovaSeq 6000平台测序）、生物信息学筛选（Galaxy分析平台进行冗余数据库NrD分析，按log_{10读数>2和轮次代表性>3标准筛选）、结合验证（电泳迁移率变动分析EMSA和酶联适配体测定ELAA）、分子对接（HADDOCK 2.4服务器模拟结合）及功能实验（细胞毒性中和实验和实验性中毒救援模型，使用人皮肤角质细胞HaCaT和CCK-8测定法）。}

结果与讨论

通过定量化筛选和测序发现CTX特异性适配体

经过12轮筛选（包括第7-8轮间的负筛选），aptamer浓度在第9-11轮达到平台期，表明筛选饱和。测序分析显示，第11轮序列的log_{10读数达2.5，轮次代表性>3，筛选出38-mer、39-mer和40-mer候选序列。HADDOCK分子对接显示40-mer（命名为40T）与CTX结合最稳定（HADDOCK得分-14.0±16.3），其序列含重复胸腺嘧啶(T)基序，可能影响测序准确性，但通过长度过滤（38-42碱基）确保可靠性。}

40T的结合分析：结构、亲和力和特异性

40T为线性单链DNA，与CTX形成“三明治”构型，结合于CTX功能环区（如Pro9、Lys19等残基）。EMSA显示随CTX浓度增加，40T-CTX复合物迁移延迟。直接ELAA测得K_{D=0.33μM，竞争性ELAA（加入随机寡核苷酸竞争者）KD=0.41μM，证实40T结合特异。40T通过静电相互作用与CTX的碱性残基（如Lys）结合，阻断其膜破坏活性。}

体外中和和实验性中毒救援效果

在体外中和实验中，40T浓度依赖性地恢复CTX（9μM）处理的HaCaT细胞活力，EC_{50=0.12μM（1.45μg/mL）。在实验性中毒救援模型（细胞先经CTX处理6h模拟中毒），40T显著提高细胞存活率，EC50=0.47μM（5.69μg/mL）。阳性对照抗CTX单链抗体(scFv) EC50=1.89μg/mL，表明40T体外中和效力更优。40T通过结合CTX功能环（如Loop I和II），阻止其膜插入和寡聚化，从而抑制细胞毒性。}

40T对眼镜蛇粗毒的中和效力

针对东南亚三种眼镜蛇毒（Naja sputatrix、Naja siamensis、Naja sumatrana），40T在实验性中毒模型中显示浓度依赖性救援效果。N. sputatrix（CTX含量48%）和N. sumatrana（44%）中毒细胞经40T（0.125-2μM）处理，细胞活力恢复率达83-240%；N. siamensis（CTX含量21%）因CTX丰度低，中和效果较弱（64-82%）。40T中和效力优于现有抗蛇毒血清（如泰国NkMAV中和需490-902μg/mL），但其效果受CTX异构体序列变异（尤其是功能Loop II）影响，提示需开发广谱适配体。

结论

本研究通过创新筛选策略发现40T适配体，能高效中和CTX及粗毒引起的细胞毒性，其结合模式阻断CTX功能表位，为治疗蛇咬伤皮肤坏死提供了首个适配体基抗蛇毒血清候选。40T在低微摩尔浓度下有效，且制备成本低、稳定性高，具有临床转化潜力。未来需优化适配体结构以提高广谱中和能力，并推进体内研究验证其治疗效能。