PD-1阻断重塑肿瘤血管微环境：单细胞测序揭示CXCL12-CXCR4轴新机制

本研究针对PD-1抑制剂疗效差异性问题，通过构建泛癌种内皮细胞单细胞图谱，发现PD-1阻断可抑制促血管生成尖端细胞亚群并下调内皮源性CXCL12-CXCR4信号通路。动物实验证实PD-1单抗与CXCR4拮抗剂AMD3100联用显著增强抗肿瘤效果，同时揭示MYC可能是调控CXCL12表达的关键转录因子，为增强免疫治疗疗效提供了新靶点。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，免疫检查点抑制剂特别是PD-1阻断剂近十年來重新定义了肿瘤治疗格局。然而临床响应率低、耐药性产生等问题依然突出，促使科学家不断探索PD-1抑制剂的作用新机制。传统研究多聚焦于PD-1抑制剂与免疫细胞尤其是T细胞的相互作用，而对肿瘤微环境（TME）中基质组分特别是内皮细胞（EC）的关注相对不足。事实上，内皮细胞作为肿瘤血管系统的关键构成者，通过调控免疫细胞浸润、血管新生和营养物质供应等多重方式参与肿瘤进展，其异质性与免疫治疗响应可能存在重要关联。

浙江大学医学院附属第一医院心血管内科团队在《Cancer Immunology, Immunotherapy》发表的最新研究，通过整合10种人类恶性肿瘤的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，构建了首个涵盖PD-1阻断治疗前后的泛癌种内皮细胞图谱，揭示了PD-1抑制剂通过调控CXCL12-CXCR4轴影响肿瘤血管微环境的新机制。

研究采用的主要技术方法包括：从GEO数据库获取10种癌症类型的scRNA-seq数据并进行质控整合；通过CellChat分析细胞间通讯网络；使用CytoTRACE2和Slingshot进行内皮细胞发育轨迹推断；利用Dorothea进行转录因子活性分析；建立Lewis肺癌小鼠模型进行体内验证；采用流式细胞术、qPCR、ELISA和免疫荧光等技术进行分子机制验证。

PD-1阻断改变肿瘤内皮细胞亚群组成

研究人员从公共数据库收集了非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤等10种恶性肿瘤的scRNA-seq数据，从中分离出18,439个内皮细胞进行整合分析。通过标记基因鉴定出8个功能不同的内皮细胞亚群：高内皮微静脉EC（HEV_EC）、动脉EC（Art_EC）、尖端细胞（Tip_EC）、毛细血管EC（Cap_EC）、静脉EC（Ven_EC）、淋巴EC（LEC）、未成熟EC（Immature_EC）和周期EC（Cyc_EC）。

分析发现肿瘤组织与正常组织的内皮细胞组成存在显著差异：肿瘤组织中Tip_EC和Cyc_EC比例显著升高，而LEC比例降低。更为重要的是，PD-1阻断治疗后，促血管生成的Tip_EC、Cyc_EC和Art_EC比例显著下降，而促进淋巴细胞浸润的HEV_EC和LEC比例上升。特别是在错配修复缺陷型结直肠癌（dMMR CRC）中，这种变化尤为明显，提示内皮细胞亚群比例变化可能与PD-1抑制剂的疗效相关。

PD-1抑制促血管生成功能并增强免疫活性

功能富集分析显示，Tip_EC富集于上皮和内皮细胞迁移、血管生成以及内皮增殖和分化相关通路，且表达最高水平的VEGFR家族基因（FLT1、KDR、FLT4）。细胞发育潜能分析表明，Cyc_EC具有最高的分化潜能，Tip_EC次之。生存分析显示Tip_EC标记基因ESM1和NID2的高表达与膀胱癌和肺鳞癌的不良预后相关。

比较PD-1阻断治疗前后的功能变化发现，未经治疗的EC富集于上皮、血管内皮和组织迁移功能，而治疗后EC则富集于MHC II蛋白组装、白细胞黏附和激活功能，表明PD-1阻断使EC从促进肿瘤迁移和血管增殖向抗原呈递和免疫细胞活性调节转变。

PD-1阻断抑制内皮源性CXCL12-CXCR4信号

细胞通讯分析揭示，PD-1阻断后上皮细胞来源的信号普遍减弱，而T/NK细胞来源的相互作用增强。特别值得注意的是，EC与T/NK细胞间的CXCL12-CXCR4信号显著减弱。进一步分析发现，CXCL12主要表达于EC和成纤维细胞，而其主要受体CXCR4则在T/NK细胞、B/浆细胞和髓系细胞高表达。

PD-1阻断治疗后，EC的CXCL12表达显著降低（p=0.00004），而CXCR4在免疫细胞上的表达水平未发生显著变化。亚群分析显示，Tip_EC、Cap_EC、HEV_EC、LEC和Ven_EC的CXCL12表达均显著下降，其中Art_EC的CXCL12表达水平最高。这些结果表明PD-1阻断通过降低EC的CXCL12表达，减弱了EC与T/NK细胞间的CXCL12-CXCR4信号传导。

联合治疗显著增强抗肿瘤效果

为验证上述发现，研究团队建立了Lewis肺癌小鼠模型，分别给予同型IgG抗体、抗PD-1单抗、CXCR4拮抗剂AMD3100以及联合治疗。结果显示，联合治疗组肿瘤重量和体积均显著小于单药治疗组和对照组（联合vs IgG，p<0.0001；联合vs抗PD-1，p<0.0001；联合vs抗CXCR4，p=0.0004）。

组织学分析显示联合治疗组肿瘤组织出现明显的淋巴细胞浸润和坏死区域。ELISA检测发现联合治疗组肿瘤组织和血浆中SDF-1（CXCL12蛋白产物）水平最低。流式细胞术分析表明联合治疗组CD31⁺EC比例显著降低。qPCR结果显示联合治疗组EC的CXCL12 mRNA表达水平显著下降。免疫荧光染色进一步证实联合治疗组CXCL12信号和CD31-CXCL12共定位明显减少。

MYC可能是调控CXCL12的关键转录因子

为探究PD-1阻断调控CXCL12表达的机制，研究人员进行了转录因子活性分析。发现HIF1A、EGR1、ETS1和MYC等转录因子活性在PD-1阻断后显著降低。通过交叉比对四个公共数据库（ENCODE、ChEA、hTFtarget和knockTF），确定MYC是最可能调控CXCL12表达的转录因子。

分析显示MYC活性在肿瘤EC中高于正常EC，且在PD-1阻断后显著降低（正常组织p<0.0001；肿瘤组织p<0.0001）。这种降低存在于除Immature_EC外的所有EC亚群。MYC过表达腺病毒实验证实，MYC过表达可显著上调CXCL12 mRNA表达（p=0.0004）。免疫荧光染色显示联合治疗组肿瘤组织中MYC染色及CD31-MYC共定位减弱，支持内皮MYC表达受抑制的结论。

临床意义与展望

生存分析显示，CXCL12高表达与结肠腺癌（COAD，p=0.020）、胃腺癌（STAD，p=0.038）、肺鳞癌（LUSC，p=0.013）和膀胱尿路上皮癌（BLCA，p=0.0002）的不良预后相关。在抗PD-1治疗队列中，CXCL12高表达组也显示出预后较差的趋势。MYC高表达与肺鳞癌（p=0.001）、卵巢癌（p=0.012）和皮肤 cutaneous细胞癌（p=0.018）的不良预后显著相关。

该研究首次通过泛癌种单细胞分析揭示了PD-1阻断对肿瘤血管内皮细胞的直接调控作用，提出了PD-1抑制剂除增强T细胞免疫外，还具有抗血管生成效应的新观点。研究发现PD-1阻断通过抑制MYC活性降低内皮CXCL12表达，进而减弱CXCL12-CXCR4信号传导，这为理解PD-1抑制剂的作用机制提供了新视角。

研究证实PD-1阻断与CXCR4拮抗剂联合使用可产生协同抗肿瘤效果，这为临床联合治疗策略提供了实验依据。特别是研究发现内皮细胞亚群比例变化可能与PD-1抑制剂的疗效相关，这为预测免疫治疗响应提供了新的生物标志物思路。

该研究的创新之处在于将研究焦点从免疫细胞扩展到肿瘤血管内皮细胞，通过多组学整合分析揭示了PD-1抑制剂的血管调控功能，发现了MYC-CXCL12-CXCR4这一新的信号调控轴，为改善免疫治疗疗效提供了新的靶点和策略。未来研究可进一步探索内皮MYC活性的调控机制，以及针对该通路的治疗策略在不同癌症类型中的应用前景。