纳豆激酶重塑肿瘤微环境增强MSLN靶向CAR-T细胞治疗实体瘤疗效

本刊推荐：为解决实体瘤中细胞外基质(ECM)屏障限制CAR-T细胞疗效的难题，研究人员开展了纳豆激酶(NKase)联合MSLN靶向CAR-T细胞的治疗研究。结果表明NKase通过降解纤维连接蛋白减少肿瘤纤维化，显著增强CAR-T细胞浸润和抗肿瘤活性，并促进记忆表型维持。该研究为改善实体瘤免疫治疗效果提供了创新性策略。

　　

近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了革命性成功，然而在实体瘤治疗领域却始终面临重大挑战。实体瘤特有的肿瘤微环境(TME)构成了一个复杂而坚固的"堡垒"，其中致密的细胞外基质(ECM)和免疫抑制因子形成了物理和生化屏障，严重阻碍了CAR-T细胞向肿瘤组织的浸润、功能发挥和持久存在。尽管CAR-T细胞工程技术不断进步，但克服这些TME屏障仍然是当前面临的主要障碍。

在这种背景下，来自南京师范大学的研究团队将目光投向了一种天然来源的纤溶酶——纳豆激酶(NKase)。这种从枯草芽孢杆菌发酵大豆过程中提取的酶类，已被证明能够降解ECM成分，促进TME重塑。研究团队前期已成功开发出靶向间皮素(MSLN)的CAR-T细胞，在卵巢癌等MSLN阳性肿瘤模型中显示出良好的治疗效果。基于此，他们提出了一个创新性的联合治疗策略：能否利用NKase改造肿瘤微环境，从而增强MSLN靶向CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果？

为了验证这一科学假设，研究团队设计了一系列严谨的实验。研究主要采用了流式细胞术分析CAR表达和细胞表型、CCK-8法检测细胞活力、荧光素酶报告基因法测定细胞毒性、蛋白质印迹法分析ECM相关蛋白表达、免疫荧光染色观察组织水平变化、三维微球体浸润实验模拟体内浸润情况，以及建立小鼠肿瘤模型进行体内疗效评估。其中使用的HCC1806(乳腺鳞癌)和OVCAR3(卵巢癌)细胞系均来自ATCC，而人外周血单个核细胞(PBMCs)则来源于健康供者。

Effects of NKase concentration on tumor cells and MSLN CAR-T

研究人员首先通过流式细胞术证实了MSLN CAR-T细胞的成功构建，结果显示CAR构建体在转导的T细胞中 robust表达。随后通过CCK-8实验发现，NKase在0-500 FU浓度范围内对HCC1806和OVCAR3肿瘤细胞活力无显著影响，在0-2000 FU范围内对MSLN CAR-T细胞活力也无明显作用。然而，当使用不同效应靶比(E/T ratio)进行荧光素酶报告实验时，发现62.5-2000 FU的NKase处理能显著提高CAR-T细胞对HCC1806细胞的裂解率，125-2000 FU的NKase能增强对OVCAR3细胞的杀伤效果。这些结果表明NKase在无明显细胞毒性的浓度下能显著增强MSLN CAR-T细胞的抗肿瘤活性，因此选择125 FU作为后续实验的最佳浓度。

NKase potentialtes MSLN CAR-T and antitumor response

为了评估NKase对MSLN CAR-T细胞功能状态的影响，研究人员通过流式细胞术分析了活化、耗竭和凋亡相关标志物的表达。结果显示，与仅用HCC1806肿瘤细胞刺激相比，用NKase处理的HCC1806细胞刺激的MSLN CAR-T细胞中活化标志物CD25和CD69表达显著上调，而耗竭标志物PD-1、LAG-3和TIM-3表达明显降低。凋亡标志物Annexin V和7-AAD在NKase处理组中也显著下调。细胞因子检测显示，与NKase处理的HCC1806细胞共孵育的MSLN CAR-T细胞释放更高水平的IL-10、TNF-α和IFN-γ。这些发现表明NKase通过促进活化、减少耗竭和降低凋亡来调节MSLN CAR-T细胞的功能表型。

NKase promotes long-term and memory phenotype in MS

通过实时细胞杀伤实验发现，在所有测试的E/T比率下，125 FU NKase预处理组的肿瘤细胞裂解率均显著高于未处理对照组。表型分析显示NKase导致T_SCM(干细胞记忆T细胞)和T_CM(中央记忆T细胞)亚群比例增加，而T_EM(效应记忆T细胞)和T_TE(终末效应T细胞)群体减少。多轮体外杀伤实验表明，与NKase处理的肿瘤细胞共培养的MSLN CAR-T细胞在所有刺激轮次中均表现出更优的杀伤能力。这些结果提示NKase能促进MSLN CAR-T细胞的记忆样表型，延长细胞寿命并维持抗肿瘤功能的持久性。

NKase enhances the infiltration of MSLN CAR-T cells and the antitumor effect in vivo

在荷瘤小鼠模型中，NKase+MSLN CAR-T治疗组表现出显著增强的抗肿瘤效果，肿瘤体积和大小明显小于对照组。流式分析显示NKase处理组中CD69表达显著上调，PD-1表达明显降低，记忆T细胞亚群向记忆表型转变，T_SCM和T_CM比例增加，T_EM和T_TE频率减少。免疫组化染色显示NKase治疗后肿瘤组织中CD3⁺ T细胞浸润增加，IFN-γ释放水平升高。重要是的，主要器官的H&E染色显示两组均无病理异常或组织损伤，表明NKase不会引起脱靶毒性。

Analysis of gene expression differences in tumor cells treated with NKase

转录组分析显示，NKase处理后肿瘤细胞中有1806个差异表达基因(DEGs)。GO富集分析表明NKase处理显著影响多种生物学过程，包括细胞粘附、ECM降解、纤溶和凋亡。凋亡相关基因热图显示多个促凋亡基因在NKase处理后显著上调。GO互作网络分析显示与肿瘤细胞迁移和粘附相关的基因显著下调，ECM结构和组织相关基因也明显下调，而ECM降解相关基因则显著上调。这些转录组变化表明NKase通过促进凋亡、抑制侵袭和促进ECM降解来重编程肿瘤微环境。

NKase disrupts tumor-associated fibronectin to enhance MSLN CAR-T cell infiltration

基因表达分析发现FN1基因表达降低，表明ECM成分纤维连接蛋白减少。免疫荧光和Western blot分析证实NKase处理后纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达显著降低。三维微球体浸润实验显示NKase处理组中MSLN CAR-T细胞浸润显著增加。体内实验也发现NKase处理的小鼠肿瘤组织中纤维连接蛋白表达明显减少。这些结果证明NKase通过促进纤维连接蛋白降解、减少纤维化来改善肿瘤微环境，促进MSLN CAR-T细胞浸润。

研究表明，NKase通过降解纤维连接蛋白、减少纤维化和促进MSLN CAR-T细胞浸润来重塑肿瘤微环境。同时，NKase通过改善CAR-T细胞的活化状态、减少耗竭和凋亡，并促进记忆样表型来增强其抗肿瘤活性。这些效应在体内外均导致更强效和持久的肿瘤杀伤作用，且不引起脱靶毒性。NKase作为一种有前景的佐剂，能够改善CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。

该研究的讨论部分指出，尽管CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得了显著进展，但其在实体瘤中的临床疗效仍受到多种因素的限制，其中肿瘤细胞的ECM被广泛认为是限制CAR-T细胞效果的关键屏障。ECM不仅作为实体瘤的重要组成部分提供结构支持，还形成了致密的物理屏障，限制包括CAR-T细胞在内的免疫细胞向肿瘤实质的浸润。此外，ECM中的纤维连接蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白等成分可通过与整合素受体相互作用激活免疫抑制通路，进一步阻碍CAR-T细胞功能并诱导细胞耗竭和失活。

NKase作为一种从纳豆枯草芽孢杆菌发酵过程中提取的丝氨酸蛋白酶，具有天然的纤溶和溶栓特性。研究表明NKase能够降解纤维蛋白和其他ECM成分，促进基质重塑，从而降低间质粘附性和机械屏障。更重要的是，NKase具有良好的安全性，在营养学和临床研究中均未报道显著毒性，这支持了其在癌症治疗中的应用潜力。

本研究首次全面研究了NKase在增强MSLN靶向CAR-T细胞治疗MSLN阳性实体瘤疗效中的协同作用。研究结果表明，NKase在非细胞毒性浓度下显著增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性活性并改善其功能状态。机制研究表明，NKase通过降低CD25和CD69等活化标志物的表达来减轻CAR-T细胞的过度活化，通过减少PD-1、LAG-3和TIM-3表达来抑制耗竭表型，同时防止凋亡，从而延长CAR-T细胞的功能持久性。此外，NKase促进CAR-T细胞向T_SCM和T_CM表型分化，表明其具有支持CAR-T细胞记忆维持的潜力。转录组分析进一步证实了这些发现，显示NKase处理显著上调了ECM降解、抑制细胞粘附和促进凋亡的相关基因表达，表明其在改善CAR-T细胞治疗结局中具有多方面的作用。体内实验还证实NKase显著增强CAR-T细胞的肿瘤浸润和抗肿瘤活性，且无明显的系统性毒性。

尽管本研究证明了NKase与MSLN CAR-T细胞联合治疗实体瘤的潜力，但仍存在几个局限性。首先，研究主要使用了两种MSLN阳性肿瘤模型HCC1806和OVCAR3，在其他实体瘤模型中是否能获得类似结果仍需进一步研究。其次，NKase的药代动力学、代谢稳定性和长期免疫原性尚未得到深入研究，针对这些方面的进一步研究对于评估NKase在肿瘤治疗中的临床适用性至关重要。此外，本研究未广泛探讨NKase对ECM产生细胞（如肿瘤相关成纤维细胞CAFs）的直接影响，这一领域值得进一步探索。

总之，本研究提供了令人信服的证据，表明NKase与MSLN CAR-T细胞联用可增强CAR-T细胞在实体瘤中的浸润、功能持久性和抗肿瘤疗效。研究结果提出了一种改善CAR-T细胞治疗的新方法，为癌症免疫治疗中的ECM调控策略提供了新见解。这些发现不仅拓宽了ECM靶向策略的治疗潜力，还为增强CAR-T细胞在实体瘤中的有效性提供了坚实的理论基础。未来需要进一步研究验证NKase作为CAR-T细胞治疗辅助药物的临床相关性，以期将其应用扩展到更广泛的实体瘤适应症。