综述：循环肿瘤细胞的单细胞RNA测序：工作流程与转化应用的实用指南

本综述系统阐述了CTC scRNA-seq技术的最新进展与临床应用，为癌症研究提供了重要方法论指导。文章详细介绍了从CTC富集、单细胞分选到数据分析的标准化12步工作流程，特别探讨了罕见CTC亚群和肿瘤-免疫杂交细胞的发现意义。作者还深入分析了机器学习在CTC鉴定中的应用潜力，为肿瘤异质性和转移机制研究提供了新视角，对推动精准肿瘤学发展具有重要价值。

　　

技术进展与临床意义

循环肿瘤细胞（CTCs）作为从原发肿瘤脱落的转移前体细胞，在癌症转移过程中扮演着关键角色。随着高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现，研究人员能够在单细胞分辨率下深入解析CTCs的转录组景观。自2012年Smart-seq协议推出以来，该领域经历了显著的技术革新，包括2013年灵敏度更高的Smart-seq2、2016年10X Genomics Chromium系统以及近年来的NICHE纳米平台和MetaCell?技术。这些进展使研究者能够对CTCs进行深度转录组分析，重新分层CTC亚型，并提高罕见新亚群的检测能力。

在临床层面，CTCs的单细胞分析为理解肿瘤微环境、表征细胞异质性、揭示转移分子机制以及改进预后和诊断策略提供了强大工具。研究表明，CTCs表现出表型可塑性，包括发生上皮-间质转化（EMT）的能力，并通过与微环境的动态相互作用增强生存和转移潜力。特别令人关注的是杂交细胞——肿瘤细胞和正常细胞融合产物，它们进一步增加了对肿瘤异质性和免疫反应理解的复杂性。

CTC分子特征与表型分析

通过scRNA-seq识别CTCs中 distinct 基因表达特征代表了分子表征的最基本水平。2014年的开创性研究首次揭示了CTCs与原发性肿瘤相比具有独特的转录组特征。研究发现CTC簇表现出低增殖特性，富含ALDH1A2（干性基因）、SPARC（基质ECM基因）、LGFBP5（上皮-基质界面标志物）的表达，并同时表达上皮和间质标志物。

在非小细胞肺癌（NSCLC）中，一项大规模研究分析了3363个单细胞CTC转录组，揭示了广泛的表型异质性。研究人员识别出包括上皮样和增殖性（簇1）、癌症干细胞样（簇4）、具有氧化磷酸化和免疫逃避特性的间质（簇5）以及具有侵袭和糖酵解特征的间质（簇6）在内的不同簇群。在神经母细胞瘤中，scRNA-seq识别出两个CTC亚群：亚群1与增加的增殖和细胞周期相关特征相关，而亚群2则表现出神经元损伤相关基因（FOS、RHOA和MIF）的过表达。

异质性精炼与微环境解析

过去五年中，CTC scRNA-seq研究显著增进了对肿瘤异质性的理解。研究表明，CTC的异质性通常基于患者特异性模式出现，反映了在不同癌症类型中观察到的 robust 肿瘤间异质性（eITH）。然而，这种多样性可能掩盖单个患者单个肿瘤内CTC共享的微妙但 significant 模式（ITH）。

研究人员证明，scRNA-seq可以量化肺癌转移中的eITH和ITH，并将这种变异性归因于转移部位的空间差异、细胞周期基因和癌症-睾丸抗原表达的变异以及CTC中的间充质和循环干细胞特性。同样，另一项研究揭示了乳腺癌患者中两个不同的CTC群体，它们在增殖和EMT特性上存在差异，并强调了免疫逃避机制，如T细胞衰竭和PD-1/PD-L1通路激活。

肿瘤微环境（TME）是一个由各种细胞类型、血管、细胞外基质和信号分子组成的动态生态系统。利用scRNA-seq可以在单细胞分辨率下解析这个生态系统，揭示CTCs与其环境之间复杂的相互作用。早期证据显示，在乳腺癌中，CTC-中性粒细胞簇富含细胞因子-受体和细胞-细胞连接相互作用，促进了细胞周期进展和转移潜力，指出了TME中潜在的治疗脆弱性。

转移与耐药机制

转移进展标志着肿瘤进化的最终和最复杂阶段。值得注意的是，它取决于上皮和间质表型之间 transition 的微妙平衡，即EMT。固有的CTC异质性推动了增殖增加、运动性增强和耐药性的获得。在单细胞水平探索这些特征为了解转移行为和肿瘤适应性提供了精细理解。

例如，研究报道了一个具有EMT特征的 significant CTC亚型，它显示血小板粘附，促进了转移性人胃癌中的EMT进展和化疗耐药性的发展。在早期乳腺癌中，具有显著肿瘤细胞特征（活化氧化应激、增殖和转移）的CTCs被细分为两个亚型：亚型1由于其部分EMT表型而表现出强转移能力，而亚型2与抗凋亡、EMT和迁移特性相关。

临床转化与应用

在识别CTC亚型和机制后，后续阶段是将这些发现转化为临床应用。将特定的CTC亚型和分子机制与临床结果相关联有助于预测疾病进展、治疗反应和总体预后。研究人员在乳腺癌中鉴定了18个与特定CTC上皮表型密切相关的基因，包括一个新的潜在glycyl-tRNA synthetase（GARS）癌基因。他们开发了一个与高转移率、低生存率、缺陷性免疫浸润和低免疫治疗反应相关的风险评分。

在非小细胞肺癌中，研究表明具有EGFR突变的HK2鉴定CTCs与降低的EGFR抑制剂疗效相关，使得早期预后和个性化治疗成为可能。在前瞻性黑色素瘤队列中，CTC scRNA-seq揭示了脂质生成和铁稳态通路的协调上调，突出了与癌症进展、耐药性和不良预后相关的SREBP驱动机制。

标准化工作流程

尽管scRNA-seq技术取得了进展，但大多数以CTC为重点的研究仍然局限于基本的转录组分析和亚型识别，临床或功能转化有限。这是由于CTCs固有的稀有性（约1个CTC每10⁷-10⁹个血液细胞每毫升）、低分离效率、差回收率以及缺乏通用的CTC特异性表面标志物/panel。

为了克服这些持续的限制，研究人员提出了一个用于CTC特异性scRNA-seq研究的标准化12步工作流程。该流程涵盖了从样本采集到生物学解释的整个过程，并分为五个主要阶段。步骤1-5包括单CTCs的预处理，包括样本处理、CTC富集（标志物依赖或独立）、表型确认、多重化和单细胞分选。步骤6-9构成平台依赖性分子处理，如单细胞裂解、mRNA分子捕获和条形码编码、cDNA合成和扩增。步骤10涉及cDNA文库制备，随后步骤11使用高通量测序仪（如Illumina NextSeq、NovaSeq或HiSeq）。最后，步骤12包括生物信息学分析——涵盖质量控制、比对、计数矩阵生成、双联检测、技术 artifacts 校正（如批次效应、细胞周期）以及下游解释包括聚类、差异表达和通路分析。

新兴研究前沿

单细胞RNA测序的最新进展扩大了CTC研究的范围，揭示了以前无法获得或识别的新的亚型、相互作用和功能状态。2022年和2025年发现了几个新的CTC群体。在2022年，使用患者来源的脑脊液（CSF）-CTCs的临床前模型在黑色素瘤中发现了IGF1R作为潜在治疗靶点，在体外和体内扩展中具有一致的基因表达谱。

2025年鉴定的CTC-血小板粘附复合物，通过FAK/JNK/c-Jun通路调节，突出了CD155在通过TIGIT相互作用免疫逃避中的上调。另一项研究发现具有增加基因组含量的CTCs（CTC-IGCs），表现出多倍体化并与典型CTCs具有克隆关系，提示了CTC生物学的新维度。

同时，杂交肿瘤细胞已被 implication 在转移中，尽管它们的分子景观和检测仍不清楚。然而，scRNA-seq的高灵敏度允许识别和分析这些杂交细胞。例如，研究人员在葡萄膜黑色素瘤中识别了肿瘤-免疫杂交细胞，这些细胞表现出增强的细胞运动性、免疫逃避和改变的新陈代谢特性，配体-受体通路可能驱动转移。

人工智能整合

随着scRNA-seq在更大规模研究中的应用增加，聚类和分析生成的海量数据的挑战已成为一个主要瓶颈。为了解决这个问题，机器学习技术被利用来简化数据分析并改进罕见细胞群体（包括CTCs和杂交细胞）的识别。

例如，研究人员对公开可用的单细胞表达谱应用机器学习技术，使得能够检测不同癌症类型中的各种CTCs，并为发现广泛使用的上皮细胞粘附分子（EpCAM）之外的一致泛癌CTC表面蛋白开辟了途径。基于这个概念，研究人员开发了基于ML的分类器，使用四个基于树的模型，在乳腺癌患者原发性肿瘤切片的Smart-Seq2数据和PBMCs上训练和测试，以及一个包含来自34个转移性乳腺癌患者（包括三阴性乳腺癌患者）的注释CTC表达谱的公共数据集。他们的 top-performing 模型在CTC测试集上实现了约95%的平衡准确率 per cell，准确识别了133个 out of 138个CTCs和CTC-PBMC簇。

超越CTC识别，ML已被应用于解决细胞异质性的复杂性。研究人员引入了一个混合指数图和马尔可夫随机场模型用于细胞异质性分析。该方法通过识别与癌症和免疫系统相关的关键标志基因，帮助克服scRNA-seq数据的高维挑战，有助于发现潜在治疗靶点。

在杂交细胞背景下，研究人员将scRNA-seq与基于ML的数据集对齐相结合，探索乳腺干细胞和乳腺癌细胞之间的表型相似性。他们揭示了正常乳腺干细胞表现出上皮、间充质和杂交上皮/间充质状态——将杂交表型与干性和肿瘤进展联系起来。

深度学习方