靶向MDM2-p53通路的β-咔啉生物碱衍生物Z-7抑制结直肠癌进展的机制与治疗潜力研究

本研究针对结直肠癌(CRC)治疗挑战，开发了一种新型β-咔啉生物碱衍生物Z-7。通过系统性的体外与体内实验，发现Z-7可有效抑制CRC细胞增殖并诱导凋亡，其机制是通过结合MDM2的RING结构域抑制E3泛素连接酶活性，从而稳定p53蛋白并激活下游信号通路。该研究为p53野生型结直肠癌提供了新的靶向治疗策略，具有重要的临床转化价值。

　　

结直肠癌是全球第二大癌症死亡原因，每年约造成90万人死亡。由于早期诊断困难，多数患者确诊时已处于晚期，发生转移后五年生存率骤降至15%左右。TP53基因作为重要的肿瘤抑制因子，在约40-50%的结直肠癌中发生突变，其余野生型p53肿瘤中则常出现MDM2基因扩增，导致p53蛋白被过度降解。靶向MDM2-p53相互作用已成为癌症治疗的重要策略，但现有MDM2抑制剂如Nutlin-3a主要通过阻断MDM2-p53结合发挥作用，开发新型作用机制的化合物具有重要意义。

β-咔啉生物碱是一类具有抗癌活性的天然化合物，其中某些衍生物已被证明可通过调节p53信号通路抑制肿瘤生长。本研究团队基于海洋天然产物Eudistomin型吲哚生物碱的结构，通过光催化对映选择性Minisci反应合成了一系列新型手性β-咔啉衍生物，并从中筛选出先导化合物Z-7。

研究人员采用CCK-8法测定细胞活力，通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡，使用蛋白质印迹法检测蛋白表达，结合转录组学和蛋白质组学分析机制，利用分子对接和pull-down实验验证相互作用，并通过小鼠异种移植模型评估体内疗效。

3.1β-咔啉生物碱衍生物Z-7抑制CRC细胞增殖

从43种β-咔啉衍生物中筛选发现Z-7对非小细胞肺癌PC9细胞的IC₅₀值为5.55μM。进一步测试显示Z-7对结直肠癌细胞(HCT116、HT29、LoVo、DLD1)和非小细胞肺癌细胞(PC9、A549、SPCA-1)最为敏感。Z-7处理显著抑制HCT116和HT29细胞增殖和集落形成能力，表明其对CRC细胞具有强效抑制作用。

3.2 Z-7诱导G2/M期阻滞和凋亡性细胞死亡

细胞周期分析显示Z-7以剂量依赖性方式诱导HCT116和HT29细胞G2/M期阻滞。流式细胞术检测发现Z-7显著增加Annexin V阳性细胞比例。蛋白质印迹分析显示Z-7处理增加了磷酸化组蛋白H2A.X(Ser139)表达，表明引起DNA损伤。有趣的是，Z-7在HCT116中诱导caspase依赖性凋亡，而在HT29中引起caspase非依赖性细胞死亡。

3.3 Z-7在p53^WT而非p53^Mut CRC中激活p53信号通路

RNA测序和KEGG通路富集分析显示，在p53野生型的HCT116细胞中，Z-7处理显著激活p53信号通路，而在p53突变型(TP53 R273H)的HT29细胞中则无此效应。qPCR和蛋白质质谱分析证实Z-7上调p21(由CDKN1A编码)、MDM2和BBC3等p53下游基因表达。在另一p53野生型CRC细胞LoVo中也观察到类似现象。

3.4 p53信号通路对Z-7在p53^WT CRC细胞中的功能至关重要

虽然Z-7不影响TP53 mRNA水平，但增加了p53和p21蛋白积累。构建TP53敲低的HCT116细胞系后，发现Z-7诱导的p53下游基因表达、细胞凋亡和周期阻滞均显著减弱，表明p53是Z-7功能的关键介质。在p53突变型CRC中，Z-7通过增加活性氧(ROS)水平诱导细胞死亡。

3.5 Z-7干扰MDM2介导的p53泛素化和降解

环己酰亚胺(CHX)追踪实验显示Z-7显著降低p53蛋白的周转率。过表达MDM2可逆转Z-7引起的p53积累。泛素化检测表明Z-7降低MDM2介导的p53泛素化水平。分子对接预测Z-7可能插入MDM2的N端疏水口袋，但竞争实验和pull-down分析发现Z-7实际结合MDM2的RING结构域，并抑制MDM2的自 ubiquitination活性，从而抑制其E3连接酶功能。

3.6 Z-7瘤内给药抑制体内CRC生长

在HCT116异种移植模型中，瘤内注射Z-7(5mg/kg)显著抑制肿瘤生长，而不引起体重减轻或明显毒性。Western blot和免疫组化分析显示Z-7处理组肿瘤中p53蛋白水平升高。口服给药实验表明Z-7安全性良好，主要器官未见病理改变。

研究表明Z-7通过两种机制抑制CRC进展：在p53野生型肿瘤中，Z-7结合MDM2的RING结构域，抑制其E3连接酶活性，减少p53泛素化降解，从而激活p53信号通路；在p53突变型肿瘤中，Z-7通过增加ROS水平诱导细胞死亡。这种双重作用机制使Z-7对不同p53状态的CRC均有治疗潜力。

讨论部分指出，虽然Z-7的IC₅₀值高于某些报道的β-咔啉衍生物，但其独特的作用机制具有重要意义。与Nutlin-3a等传统MDM2抑制剂不同，Z-7不干扰MDM2-p53相互作用，而是直接抑制MDM2的E3连接酶活性，这为开发新型MDM2抑制剂提供了新思路。此外，Z-7对p53突变型CRC的有效性克服了传统铂类药物的耐药性问题。

该研究的临床意义在于：Z-7可能特别适用于MDM2扩增的p53野生型CRC患者群体；Z-7对p53突变型CRC的有效性为克服化疗耐药提供了新策略；良好的安全性特征支持其进一步临床开发。未来研究可探索Z-7与免疫治疗的协同作用，因为MDM2-p53通路在抗肿瘤免疫中也发挥重要作用。

总之，Z-7作为一种新型MDM2抑制剂，通过创新机制抑制CRC进展，具有重要的转化医学价值和临床开发前景。