靶向EphA2的177Lu标记环肽联合HPK1抑制剂协同抗肿瘤研究：分子探针开发与免疫调控新策略

为解决冷肿瘤对177Lu放射性疗法的耐药性问题，研究人员开发了靶向EphA2的环肽CEMJ4，并联合HPK1抑制剂（HPK1i）开展协同治疗研究。结果表明，177Lu-DOTA-CEMJ4可特异性抑制肿瘤生长，而HPK1i可逆转177Lu引起的T细胞免疫抑制，显著增强抗肿瘤免疫应答。该研究为放射免疫联合治疗提供了新思路。

　　

在肿瘤治疗领域，放射性核素治疗（Targeted Radionuclide Therapy, TRT）已成为一种重要的精准治疗手段，尤其是¹⁷⁷Lu标记的靶向药物在神经内分泌肿瘤和前列腺癌中取得显著进展。然而，面对免疫细胞浸润不足的“冷肿瘤”，单纯依靠TRT往往疗效有限，甚至可能因引发免疫抑制而适得其反。此外，尽管EphA2（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2）作为跨膜酪氨酸激酶受体在多种实体瘤中高表达，已成为一个有潜力的治疗靶点，但针对该靶点的抗体药物和小分子抑制剂在临床研究中仍未取得理想效果。

在这一背景下，研究人员致力于开发新型EphA2靶向肽类放射性药物，并探索其与免疫疗法的联合应用策略。发表于《Cellular Oncology》的这项研究，通过噬菌体展示技术筛选出一种高亲和力的环肽CEMJ4，将其与¹⁷⁷Lu及⁶⁸Ga分别偶联，用于治疗和诊断，并进一步联合HPK1抑制剂（HPK1i），在黑色素瘤模型中实现了显著的协同抗肿瘤效果。

本研究主要采用以下关键技术方法：噬菌体展示筛选EphA2结合环肽；表面等离子共振（SPR）测定肽段亲和力；⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu标记与稳定性检测；Micro-PET/CT显像与生物分布分析；体外细胞实验（包括结合内化、CCK-8、凋亡、迁移与侵袭实验）；以及体内疗效评价（使用B16F10荷瘤小鼠模型，样本来源于C57BL/6J小鼠）。此外，还通过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等手段评估免疫细胞调控机制。

2.1 通过噬菌体筛选靶向人EphA2胞外域的环肽

研究人员通过三轮严格条件下的噬菌体筛选，从包含11个子库的混合肽库中富集出4种候选环肽，均来源于2-半胱氨酸子库，经2,6-双(溴甲基)吡啶（BBP）环化后形成单环肽。测序分析显示，这些肽段均含有(F/Y)XACPX_2-3C保守基序，其中CEMJ1和CEMJ4在第三轮筛选中丰度最高。

3 候选肽与EphA2的亲和力表征

SPR测定表明，环化后的CEMJ4与EphA2的结合亲和力K_D=0.3±0.2μM，优于线性肽（K_D=16.8μM）。连接DOTA后，DOTA-CEMJ4仍保持纳摩尔级亲和力（K_D=0.16±0.05μM），表明其适合用于放射性标记。

In vitro and in vivo specificity evaluation of ⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4

放射性标记后的⁶⁸Ga/¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4在体外和体内均表现出高稳定性。细胞实验显示，该探针可特异性结合EphA2高表达的B16F10细胞，且摄取随时间递增，而阻断实验进一步验证了其靶向特异性。竞争性结合实验得出IC₅₀值为314.1 nM（⁶⁸Ga）和550.8 nM（¹⁷⁷Lu），与SPR结果一致。

4 In vivo specificity and biodistribution of ⁶⁸Ga-DOTA-LEMJ4 and ⁶⁸Ga-DOTA-CEMJ4

Western blot验证多种肿瘤细胞系中EphA2表达水平，发现B16F10和A375表达最高。Micro-PET/CT显像显示，⁶⁸Ga-DOTA-CEMJ4在B16F10和A375移植瘤中摄取较高（分别为4.5% ID/g和2.1% ID/g），且环肽版本比线性版本具有更高的肿瘤滞留性。生物分布结果证实其主要通过肾脏排泄，非靶器官摄取低。

Evaluation of the anti-tumor effect of ¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4 in vitro

CCK-8实验表明，¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4对B16F10细胞具有更强的抑制效果（IC₅₀=18.02 MBq/mL）。进一步实验显示，该药物可抑制细胞克隆形成、迁移与侵袭，并引起DNA损伤（γ-H2AX表达升高）和凋亡（Annexin V/PI阳性率增加）。

HPK1 inhibitor alleviates the inhibitory effect of ¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4 on T cell activation in vitro

研究发现，¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4以剂量依赖方式抑制T细胞中p-AKT和p-ERK信号通路，降低IL-2和IFN-γ分泌，并抑制T细胞增殖。而HPK1i可逆转上述免疫抑制效应，恢复T细胞活化和细胞因子释放。

HPK1 inhibitor synergizes with ¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4 to enhance anti-tumor efficacy in vivo

在B16F10荷瘤小鼠模型中，高剂量（14.8 MBq）¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4单药可显著抑制肿瘤生长，而低剂量（3.7 MBq）单药效果有限。与之相比，低剂量¹⁷⁷Lu-DOTA-CEMJ4联合HPK1i可显著降低肿瘤负荷，增加肿瘤内CD4⁺、CD8⁺ T细胞和M1型巨噬细胞浸润，减少PD-1⁺CD8⁺ T细胞比例，并增强肿瘤细胞凋亡与DNA损伤。

该研究不仅成功开发出一种新型EphA2靶向环肽CEMJ4，可用于肿瘤的精准诊断与治疗，还揭示了¹⁷⁷Lu放疗对T细胞的免疫抑制机制，并证明通过联合HPK1抑制剂可有效逆转该抑制，激活抗肿瘤免疫应答。这一策略为改善冷肿瘤对放射治疗的响应提供了新思路，具有较强的临床转化潜力。此外，研究中所采用的噬菌体展示筛选、环肽优化、多模态分子影像评价等方法也为未来开发类似靶向肽药物提供了重要技术参考。