野猪作为病毒传播网络关键节点：宏病毒组揭示其在中国野生动物与家畜间的病毒循环及公共卫生意义

本研究针对野猪在病毒传播生态中的关键作用被长期忽视的问题，通过全国范围的宏病毒组分析，系统解析了野猪病毒组的组成特征及其传播动态。研究人员对来自中国26个省份127个地点的466头健康野猪和50头死亡野猪的2535份器官样本和274份血液样本进行DNA特异性多重置换扩增（MDA）和RNA特异性宏转录组（MTT）测序，构建包含9281个病毒序列的BrCN-Virome数据库。研究发现野猪病毒组与家猪存在显著差异，其DNA病毒多样性显著扩展，并鉴定到多个与人类、家畜、野生动物和节肢动物相关的病毒，包括非洲猪瘟病毒（ASFV）、经典猪瘟病毒（CSFV）等重要病原体。研究证实野猪是连接不同动物类群病毒传播网络的关键节点物种，其携带的病毒不仅对养猪业构成重大威胁，还对野生动物保护和公共卫生带来挑战，强调了开展野猪病毒常规监测和种群控制的必要性。

　　

在当今新发和再发传染病频繁暴发的时代，野生动物作为病毒天然储库的作用日益受到关注。然而，在蝙蝠、啮齿类、蜱类等明星物种被广泛研究的同时，野猪（Sus scrofa）作为病毒传播的关键节点物种却被长期忽视。这种广泛分布于欧亚大陆的偶蹄目动物，不仅在人类主导的农业区和城市社区中频繁出现，更因其与家猪无免疫学和生理学屏障的特点，成为多种病毒传播的桥梁。随着野猪种群数量的增加，它们对农作物的破坏、与家畜和人类的冲突，以及向其他动物传播疾病的风险日益凸显，使其在欧洲和中国被视为害兽而受到积极压制。

尽管已知野猪是许多病毒的天然储库，但其在病毒携带和传播中的作用一直被其他动物所掩盖。先前的研究多基于野猪作为猪病原体储库的立场，发现经典猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV）、猪细小病毒（PPV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）等猪病原体可在野猪中稳定循环，成为家猪的重要感染源。此外，一些人兽共患病毒如甲型流感病毒（IAV）、日本脑炎病毒（JEV）也在野猪中被检测到，给密切接触者带来潜在暴露风险。然而，野猪病毒的广度和传播动态却鲜有研究，这与它们的种群数量、分布范围和生态角色极不相称。

为了解决这一知识空白，研究人员开展了一项全国范围的野猪泛病毒组研究。通过结合DNA特异性多重置换扩增（MDA）和RNA特异性宏转录组（MTT）病毒组方法，解密了野猪病毒在媒介、野生动物、家畜和人类之间的传播动态。该研究为了解野猪病毒多样性及其与其他动物类群的生态和流行病学关系提供了重要见解，将有助于预测潜在的野猪相关新发传染病。

研究团队在2018-2024年间收集了来自中国26个省份127个地点的466头健康野猪和50头死亡野猪的2535份肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、扁桃体及下颌、腹股沟和肠系膜淋巴结样本，以及274份血液样本。研究人员制备了95个单个体（si-）和66个多个体（mi-）MTT文库、81个si-和53个mi-MDA文库，以及9个si-宏基因组（MTG）文库进行病毒组测序。其中60个si-和44个mi-处理同时进行了MTT和MDA配对文库制备和测序。研究还收集了寄生于部分野猪的蜱虫，包括来自安徽的2只阿姆斑蜱（Amblyomma testudinarium）和2只斯氏革蜱（Dermacentor steini），以及来自广东的3只豪猪血蜱（Haemaphysalis hystricis）。

主要技术方法包括： 采用RNAiso Plus试剂提取总RNA并经磁珠纯化，使用RiBo-Zero Magnetic Gold kit去除核糖体RNA；使用DNeasy Blood and Tissue kit提取DNA，经Illustra GenomiPhi V2 DNA扩增kit进行等温扩增；使用NEBNext Ultra定向RNA文库制备kit和NEBNext Ultra DNA文库制备kit构建文库；使用NovaSeq 6000测序仪进行双端150bp测序；通过megahit进行从头组装，使用DIAMOND BLASTP和hmmscan进行病毒样序列识别；采用CheckV评估序列质量，使用MMseqs2进行 taxonomic clustering分析。

野猪病毒组概览

从这些野猪文库中，研究人员共恢复了9281个外源性真核病毒序列（即BrCN-Virome），其中至少2779个为完整基因组或包含完整编码区。BrCN-Virome覆盖4个RNA和5个DNA病毒门，有3724和3393个序列分别归属于46个已知科中的已知和新物种，其余2164个被分类为至少14个目中的新科。由于MDA技术倾向于扩增单链环状DNA分子，环状Rep编码单链（CRESS）DNA病毒在BrCN-Virome中占比过高，达49.0%（n=4588）。双链DNA病毒也被有效回收，占数据集的14.5%（n=1361），其中大部分为ASFV序列。

研究人员鉴定了BrCN-Virome的2551个全长病毒标志基因（VHGs），即243个RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）和2308个主要衣壳蛋白（MCP）序列。在亚属水平（即序列在80%覆盖度上具有90%平均氨基酸同一性[AAI90]），这些VHG序列被分为1137个病毒簇（vcAAI90），每个配对文库平均捕获30.1±25.3个vcAAI90s。值得注意的是，这些vcAAI90s中没有一个在样本中显示>50%的阳性率，只有猪星状病毒（PoAstV）和猪 mastadenovirus（PoAdV）在20-38%的配对文库中出现，表明野猪病毒组在不同文库间存在显著差异。

野猪与家猪病毒组组成的差异

研究人员制备了家猪的VHG数据集，并在AAI50水平（类似于病毒科水平）与BrCN-Virome的对应部分进行聚类。总共生成了1145个vcAAI50s，其中605个为BrCN-Virome特有，479个为家猪特有，只有61个为两组共享。BrCN-Virome在黄病毒科（Flaviviridae）、布尼亚病毒目（Bunyavirales）、全病毒科（Totiviridae）、圆环病毒科（Circoviridae）和CRESS DNA病毒、乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）中具有更丰富的多样性。

值得注意的是，家猪携带的病毒更加多样化，包括星状病毒（AstVs）、杯状病毒（caliciviruses）、小RNA病毒（picornaviruses）、细小病毒（parvoviruses）、腺病毒（AdVs）、疱疹病毒（herpesviruses）和痘病毒（poxviruses）。大多数共享病毒是sedoreoviruses和ASFVs。这表明野猪和家猪之间的病毒多样性存在差异。CLANS分析显示，BrCN-Virome对这些RNA病毒的遗传多样性贡献有限，但包含丰富多样的CRESS DNA病毒，并为乳头瘤/多瘤病毒 mega-cluster贡献了大量遗传新颖性。

系统发育分析揭示多个关注病毒

通过VHG序列量化BrCN-Virome的遗传多样性，发现在AAI90水平，有815个vcAAI90s不与已知家猪病毒共享，即至少为猪科动物病毒多样性增加了815个新亚属。大多数新的vcAAI90s由DNA病毒贡献，特别是圆环病毒贡献了319个vcAAI90s。然而，BrCN-Virome仅对RNA病毒贡献了52个新的vcAAI90s。

基于2079个全长VHG序列进行的科/目水平系统发育分析显示，总共381个VHG序列覆盖至少19个科，与GenBank中的已知参考序列具有99%以上的AAI相似性，其中76.9%（n=293）被注释为这些猪病毒，如CSFV、PPV、PCV、AstV、AdV和ASFV，其余与乳头瘤病毒、A组轮状病毒（RVA）、阿卡班病毒（AKAV）、犬瘟热病毒（CDV）、Mogiana蜱病毒等人类、牛、食肉动物和蜱源病毒相关。

此外，研究人员在BrCN-Virome中发现了21个与啮齿动物wawtorqueviruses密切相关的anellovirus序列（AAI：81.0-98.5%），以及一个与人类gammapapillomaviruses显示远缘系统发育关系（AAI：51.4-64.5%）的乳头瘤病毒支系和3个多瘤病毒序列。

系统发育分析揭示了多个野猪病毒与人类或家畜传染病存在明显或潜在关联。进一步分析显示，18种关注病毒感染家猪、牛、食肉动物、绵羊和人类，出现在22个省份的野猪中。其中，ASFV、CSFV、PCV2、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、PPV1和RVA是通常对养猪业造成严重损害的著名猪病原体。PCV2和ASFV分布广泛，分别出现在18个和11个省份。

值得注意的是，97.6%（41/42）的ASFV阳性文库和65.0%（13/20）的CSFV阳性文库由死亡野猪样本组成。然而，对于其余猪病原体，大多数阳性文库由活野猪样本组成。导致草食家畜生殖异常的阿卡班病毒（AKAV）在广西壮族自治区的野猪中发现。研究人员未发现与人类病原体密切相关的野猪HEV，但一些野猪RVA序列在7个省份出现，与人类病原体的平均核苷酸同一性（ANI）高达97.1%。对食肉动物致命的犬瘟热病毒（CDV）在相邻的吉林和辽宁省被发现。

野猪病毒传播谱分析显示，至少24种野猪病毒可追溯至家猪、人类、蜱虫、鸟类、食肉动物、牛、绵羊和啮齿动物，其中18种负责人类和其他动物的各种疾病。与其他宿主的相互作用相比，野猪病毒与家猪的相互作用更加多样化，涉及16种病毒。研究人员还注意到细小病毒和多瘤病毒在野猪与蓝尾鸟、鹤、伯劳和啮齿动物之间的传播。

蜱相关病毒传播

通过在AAI90水平查询ZOVER数据库的蚊子和蜱虫分支，研究人员发现458个BrCN-Virome序列中的37个物种属于至少11个病毒科，与至少23种蜱虫和6种蚊子相关。基因瘤病毒（genomoviruses）最多样化，涉及11种病毒。其次是圆环病毒，有5个物种，包括PCV2和PCV3。黄病毒科、Peribunyaviridae、Phenuiviridae和Rhabdoviridae科中的一些病毒也在BrCN-Virome中发现，如Rhipicephalus相关黄样病毒、Mogiana蜱病毒、广西蜱病毒、AKAV、铜仁蜱病毒1、Ledantevirus yongjia和Ledantevirus longquan。

长角血蜱（H. longicornis）与13种BrCN-Virome病毒相关，其中8种为基因瘤病毒。微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）与这些野猪的8种病毒相关，除一种Hepeviridae sp.外，均为已知的媒介传播病毒。

2个蜱虫MTT文库使研究人员能够进一步确认传播，从中恢复了77个外源性真核病毒序列，代表黄病毒科、内罗病毒科（Nairoviridae）、Phenuiviridae、Rhabdoviridae等科的22个物种。两个蜱虫文库显示出显著不同的病毒组组成。安徽文库（AHST1901）主要由黄病毒样序列组成，而广东文库（GDST1901）主要与布尼亚病毒、弹状病毒等相关。

研究人员将两个蜱虫病毒组与BrCN-Virome进行比较，发现AHST1901病毒组的4种病毒与10个野猪文库相关。值得注意的是，AHST1901的蜱虫采集自AnHH1905的野猪；这4种AHST1901病毒都存在于AnHH1905文库中，ANI高达100%。Mogiana蜱病毒分布在所有10个野猪文库中，在某些野猪文库中的相对丰度超过200 RPM，表明该病毒在野猪中活跃复制。

健康、死亡和ASFV致死野猪的病毒组特征

为了调查野猪的死亡原因，研究人员首先检查了60个死亡野猪si-文库中关注病毒的分布。51个文库与这些猪病原病毒感染相关，其中74.5%（n=38）与ASFV（n=15）、CSFV（n=7）和PCV2（n=5）的单一感染以及ASFV和PCV2的共同感染（n=11）相关。

在这些配对处理中，50个和45个分别是死亡野猪（db）和表观健康个体（hi）的组织。研究人员随后比较了两种文库类型的病毒组组成。db-和hi-病毒组分别捕获了691和436个vcANI90s。vcANI90的积累曲线表明两种类型的病毒组均未达到饱和。这些hi-文库的样本内病毒多样性显著低于db-文库（Wilcoxon秩和检验，p=6.772e-07）。

总共26个vcANI90s在两种文库类型间显示不同的丰度模式，其中14个是ASFV，其余是AstV、α-多瘤病毒、PCV3和未分类的CRESS DNA病毒。AstV和PCV3倾向于出现在这些hi-文库中，但ASFV、α-多瘤病毒和CRESS DNA病毒在db-文库中显示更高的阳性率。事实上，AstV出现在42.2%（n=19）的hi-文库中，但仅出现在14.0%（n=7）的db-文库中。相反，ASFV在60.0%（n=30）的db-文库中呈阳性，但仅在一个hi-文库中呈阳性。这些表明ASFV感染是野猪死亡的主要原因。

研究人员进一步检查了ASFV感染对病毒组组成的影响。在这些ASFV阳性db-文库（db-ASFV）中，ASFV非常丰富，平均RPM为402.5±200.5。但出乎意料的是，除ASFV外，所有其他病毒在≤26.7%（n=8）的db-ASFV文库中稀疏分布，且很少有比ASFV更丰富的。然而，hi-文库（排除ASFV阳性者）中的病毒分布更均匀，有18个与PCV2、AstV和AdV相关的vcANI90簇存在于≥27.3%（n=12）的hi-文库中。特别是，hi-文库中的病毒非常丰富，平均RPM为495.4，远高于db-ASFV文库中的病毒（平均RPM=122.8）（t检验，p=0.001289）。这些表明ASFV感染抑制了其他病毒的复制。

野猪中的ASFV变种

研究人员从ASFV阳性si-文库中提取了29个ASFV B646L基因的全长序列，并与参考序列进行系统发育分析。这些序列分为I和II基因型，与参考序列具有99.9-100%的nt同一性。大多数（n=24）这些序列属于基因型II（GII），2023年和2024年采集的5个属于基因型I（GI）。

所有个体的分子检测显示，60%（36/60）的死亡野猪ASFV呈阳性，包括通过病毒组分析检测呈阳性的33个。在通过PCR检测到ASFV但未通过病毒组测序检测到的3个样本中，所有都被归类为GII病毒，病毒载量极低，Ct值>35。基于扩增子的基因分型证实了系统发育分析。

此外，研究人员使用基于片段contigs的方法检测了野猪中ASFV的重组事件。所有GII ASFV的片段contigs与GII参考序列密切匹配，nt同一性为99.5-100%，表明没有发生重组。然而，GI病毒的片段contigs交替映射到GI和GII参考序列，即所有GI ASFV都是GI/II重组病毒。

值得注意的是，研究人员发现文库JiXS2402的一些片段ASFV contigs相互重叠，与参考序列显示不同的同一性。研究人员随后从样本中扩增了整个B646L基因，并随机挑选15个克隆进行Sanger测序。令人惊讶的是，这些克隆非常异质。大多数（n=11）克隆与通过病毒组测序组装的序列相同。然而，其中1个被归类为II型，与参考序列有99.9%的nt同一性。特别是，有一个无法基于ASFV基因分型标准稳健地分类到任何基因型。这表明个体JiXS2402同时感染了多个ASFV变种。

研究结论与意义

这项研究代表了迄今为止为阐明野猪病毒组景观而进行的最全面调查。尽管野猪在生理和遗传上与家猪高度相似，但BrCN-Virome在家猪病毒遗传多样性方面与家猪病毒组存在明显区别。这种差异可能部分归因于本研究使用的样本类型和病毒组技术。所有涉及的样本都是内部实体器官组织和血液样本，因此那些主要在消化道复制的病毒，如AstV、杯状病毒等，很少被检测到。

野猪本身的特性在塑造病毒组组成方面也起着重要作用，因为它们深度参与各种生态系统。例如，野猪在野外自由活动，经常被节肢动物寄生，使它们有更高机会感染布尼亚病毒目、黄病毒科、弹状病毒科等的媒介传播病毒。有趣的是，wawtorqueviruses主要在啮齿动物中检测到，gammapapillomaviruses和deltapolyomaviruses主要与人类感染相关，但这些病毒很少在猪科动物中发现。它们的亲属在野猪中的发现表明这些病毒的宿主范围可能扩大。

在本地生态系统中，所有生命形式通过食物链、共享栖息地、资源竞争等直接或间接相互作用，这为病毒传播和跨物种传播提供了充足条件。本研究解码了野猪与其他物种之间的病毒传播动态，证明野猪是连接人类、家畜、野生动物和节肢动物的病毒传播网络中的节点物种。在这些传播病毒中，大多数与家猪相关，表明野猪是猪病毒的主要天然储库。一些病毒已知对猪、人类、绵羊、牛和食肉动物有致病性，但其余显示不确定的致病性。这些猪病原体广泛分布于中国各地的野猪中，其中一些对野猪也是致命的，如ASFV、CSFV等。在野猪中检测到CDV和AKAV是罕见事件但令人担忧，因为它表明野猪参与其他物种病原体的维持和跨物种传播。

野猪是医学上重要蚊子和蜱虫的理想天然宿主，因此可被视为识别潜在媒介传播病毒的哨兵动物。尽管尚未与任何新发传染病相关，但这四种蜱传黄病毒是潜在的关注风险，因为它们在野猪组织样本中被检测到，表明它们能够在哺乳动物中复制。

研究数据表明，病毒感染是野猪死亡的重要原因，ASFV是主要病原体，其他病原体如CSFV和PCV2也起作用。通过比较ASFV阳性和ASFV阴性野猪的病毒组特征，发现ASFV阳性个体感染了更多样化的病毒，但丰度较低。这表明ASFV感染扰乱了宿主的病毒群落，这应该是ASFV感染后宿主免疫抑制的结果，这使得多种病毒能够入侵宿主。这些病毒的较低丰度应归因于宿主细胞因ASFV感染而功能失调，从而干扰了病毒复制。

自2018年传入中国以来，GII ASFV给养猪业带来了灾难性打击，其传播到野猪种群中使情况复杂化。2021年，低毒力GI ASFV在中国出现，虽然流行率低，但在2022年导致GI和II重组毒株。这些反映了ASF在中国猪中的流行变化迅速且变得非常复杂。研究数据表明，GII ASFV是中国野猪中的主要基因型。研究人员在野猪中发现了一个同时感染五种不同ASFV变种（即GI、GII和其他三个基因型未定）的ASF病例。多重ASFV变种的同时感染，特别是不同基因型的感染，很少有报道，无论是在猪还是野猪中。

本研究刷新了我们对野猪在病毒跨物种传播中作用的理解，强调野猪病毒不仅对健康养猪业构成重大挑战，还对野生动物保护和公共卫生带来重大威胁。应考虑采取一些对策来减轻潜在威胁。通过围栏/物理屏障加强自由放养系统的生物安全，监测食物/水/清洁度并将其升级为集约化工业化生产，可以切断它们与家猪接触的机会。通过分发含疫苗的饵料主动为野生动物接种疫苗已被证明是应对野生动物疾病的成功策略。应常规监测野猪病毒以了解其进化和分布动态。此外，通过狩猎或诱捕等措施减少野猪种群是另一种可能的措施。

该研究由农业农村部长春兽医研究所、国家林业和草原局生物灾害防控中心等单位合作完成，研究成果发表于《Nature Communications》期刊，为理解野猪病毒多样性及其生态和流行病学意义提供了重要科学依据。