MEG3基因变异与Ki-67、p53、CK18免疫组化标记物在垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）临床特征中的关联研究

本研究探讨了MEG3基因rs7158663和rs4081134变异及Ki-67、p53、CK18免疫组化标记与垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）临床特征的关系。结果显示p53 H-score与肿瘤大小和侵袭性显著相关，CK18阴性表达与非功能性和侵袭性PitNETs相关，提示二者可作为潜在预后标志物。

　　

1 引言

垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs）是最常见的鞍区肿瘤，根据其激素活性分为功能性和非功能性。流行病学研究显示，临床显著PitNETs的患病率约为1/1100。其中泌乳素瘤约占53%，且在女性中的发生率约为男性的十倍。根据肿瘤大小，PitNETs可分为微腺瘤（<1 cm）和大腺瘤（>1 cm）。大腺瘤常压迫视交叉导致视野缺损，还可引起头痛或垂体功能减退。功能性PitNETs根据细胞谱系分为促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞、促肾上腺皮质激素细胞、泌乳素细胞和生长激素细胞肿瘤，分别表现为性腺功能减退、甲状腺功能亢进、库欣病、高泌乳素血症和肢端肥大症。非功能性PitNETs通常表现为占位效应和垂体功能减退。

根据2022年世界卫生组织（WHO）内分泌和神经内分泌肿瘤分类，PitNETs通过免疫组化反应确定细胞谱系。PIT1谱系包括生长激素细胞、泌乳素细胞和促甲状腺激素细胞腺瘤；TPIT和SF1谱系分别包括促肾上腺皮质激素和促性腺激素细胞腺瘤；缺乏激素或转录因子表达的肿瘤被定义为零细胞腺瘤。然而，目前尚无明确的形态学标准或单一预后生物标志物能够预测肿瘤生长或恶性进展。

母系表达基因3（MEG3）是一种位于染色体14q32.3的长链非编码RNA（lncRNA），其主要功能包括调节p53肿瘤抑制基因表达和通过多种机制诱导p53依赖性转录。MEG3通过与多梳抑制复合物2（PRC2）及其辅因子JARID2相互作用，抑制MDM2和CDH1表达，分别导致p53激活和上皮-间质转化（EMT）减少。此外，MEG3可直接结合p53并激活生长分化因子15（GDF15）表达，从而抑制癌细胞增殖和侵袭。MEG3在多种肿瘤中表达下调，包括头颈部鳞状细胞癌、神经母细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、视网膜母细胞瘤和甲状腺癌，但其与PitNETs的关系研究较少。

Ki-67是一种与细胞增殖相关的核蛋白，在细胞周期所有活性阶段（G₁、S、G₂和M期） except G₀期均可检测到。由MKI67基因编码的Ki-67在有丝分裂中发挥多种作用，包括染色体周围蛋白区室的组装、异染色质的组织、染色体与纺锤体的附着以及有丝分裂末期大分子细胞质从细胞核的排除。大量研究表明，较高的Ki-67标记指数（LI）与较差的生存率、较大的肿瘤大小、淋巴侵袭和转移相关。在神经内分泌肿瘤中，多项研究评估了Ki-67 LI的预后作用。结合形态学和放射学证据，Ki-67 LI在识别具有较高复发或局部侵袭风险的PitNETs方面显示出潜力。不成熟PIT1谱系、Crooke细胞、零细胞、沉默促肾上腺皮质激素细胞、稀疏颗粒型生长激素细胞和促肾上腺皮质激素细胞腺瘤表现出更具侵袭性的行为，但Ki-67在PitNETs中的独立预后作用尚不清楚。

p53是一种转录因子，在几乎所有肿瘤中均失活，其中约50%与TP53突变相关。除了在细胞周期阻滞、凋亡和衰老中的作用外，p53还负责广泛的肿瘤抑制功能。p53作为代谢调节剂，抑制合成代谢反应（糖酵解、脂肪生成）并激活分解代谢过程（氧化磷酸化、脂肪酸氧化）。此外，p53促进铁死亡，作为代谢应激条件下细胞清除的替代途径。虽然p53的功能作用和免疫组化模式已在多种癌症中得到广泛研究，包括高级别浆液性癌、子宫内膜癌、高级别膀胱癌和前列腺癌，但其在PitNETs中的具体作用仍知之甚少。

细胞角蛋白18（CK18）是一种中间丝蛋白，与细胞角蛋白8（CK8）共表达，形成异聚体并组装成 keratin 丝，存在于上皮细胞的细胞质中。除了结构和保护作用外，CK18还参与多种细胞过程，包括凋亡、细胞周期进程、有丝分裂和细胞信号传导。Menz等人的一项大型研究揭示了CK18在多种癌症中的参与。研究表明，CK18在大多数腺癌中强烈表达，尤其是起源于肺、前列腺、结肠、胰腺和卵巢的腺癌。此外，起源于CK18阳性组织（如乳腺和肾癌）的肿瘤可能下调CK18表达，导致更具侵袭性的肿瘤发展和较差的预后。在神经内分泌肿瘤中，CK18免疫组化广泛用于PitNETs的组织病理学分类，例如稀疏颗粒型生长激素肿瘤中的CK18纤维小体和促肾上腺皮质激素腺瘤中的Crooke细胞。然而，迄今为止，CK18免疫组化反应类型与PitNETs临床特征之间的关系尚未建立。总体而言，MEG3、Ki-67、p53和CK18为了解肿瘤生物学提供了独特视角，但它们对PitNETs临床病理特征的影响尚不清楚。

鉴于它们在多种恶性肿瘤中的参与，本研究旨在探讨MEG3遗传变异、Ki-67、p53和CK18在PitNETs发展中的临床病理作用，以阐明其预后价值、与肿瘤侵袭性和临床特征的关联，可能有助于改善神经内分泌肿瘤的管理。

2 研究方法

2.1 研究组织

本研究在立陶宛健康科学大学（LUHS）神经科学研究所的眼科实验室进行。DNA和肿瘤组织样本于2014年至2024年间在该机构收集，作为常规诊断和研究程序的一部分。考纳斯地区生物医学研究伦理委员会批准了该研究（批准号BE-2-47，2016年12月25日签发）。研究分为四个阶段：第一阶段进行科学文献分析，并使用盐析法从受试者静脉血白细胞中提取DNA；第二阶段使用实时聚合酶链反应（RT-PCR）测定lncRNA MEG3 rs4081134和rs7158663基因型；第三阶段在LUHS医院KK病理解剖科测定免疫组化标志物Ki67、p53和CK18；第四阶段使用统计程序分析结果，进行描述并准备报告。

2.2 受试者选择

研究参与者分为两组：

PitNET患者组（n=120）：女性69人（57.5%），男性51人（42.5%）。纳入标准为年龄≥18岁、一般健康状况良好、无任何肿瘤（垂体肿瘤除外）的患者。PitNET通过磁共振成像（MRI）识别和验证。

PitNET组根据复发、激素活性和侵袭性进一步分组。根据组织病理学视图分为侵袭性和非侵袭性类别；根据血清激素水平分为活性和非活性PitNET组。如果在随访MRI中发现新生长或残留肿瘤扩展，则指示复发。如果在研究期间手术切除后的随访MRI中看到新生长或残留肿瘤扩展，则确定为PitNET复发。如果随访MRI显示无肿瘤进展迹象，则认为残留肿瘤稳定。

对照组由220人组成：女性120人（54.5%），男性100人（45.5%）。健康对照组参与者与PitNET组在年龄和性别上匹配，且总体健康状况良好。

所有研究受试者签署了知情同意书。从每位研究参与者的外周静脉采集血液。

2.3 DNA提取和基因分型

所有研究参与者的血液采集在含乙二胺四乙酸（EDTA）的真空管中以防止凝血。本研究使用白细胞盐沉淀法从研究参与者的静脉血中分离DNA。方法如先前所述使用。使用StepOne Plus放大器（Applied Biosystems, USA）通过RT-PCR测定MEG3 rs4081134和rs7158663变异的lncRNA基因型。所选lncRNA变异的基因型根据制造商StepOne Plus（Applied Biosystems）的方案测定。基因分型条件和变异特征的方案见表1。

2.4 SNV选择

我们选择的两个SNV（rs7158663和rs4081134）均为内含子区；此类变异可能对lncRNA表达、剪接或结构产生显著影响，进而影响下游肿瘤抑制通路。在如MEG3的lncRNA中，内含子区域也可能包含对RNA稳定性或与蛋白质和其他RNA相互作用至关重要的调控 motif 或结合位点。这些SNV先前已在其他人群中研究过癌症易感性和预后。特别是，rs7158663已被报道影响MEG3表达水平，可能影响癌症风险。据我们所知，rs7158663和rs4081134尚未在PitNETs背景下进行深入研究，这为探索新关联和贡献新数据提供了机会。

2.5 免疫组织化学

手术材料用10%福尔马林溶液固定后，使用Shandon Pathcentre处理器（Shandon, UK）对PitNET组织进行标准化石蜡包埋程序。在TBS88系统（Medite, Germany）中形成PitNET组织石蜡块后，使用Leica RM2125RT旋转切片机（Leica Biosystems, Germany）制作2 μm厚切片。

Ki-67 LI和p53蛋白标志物的免疫组化反应使用自动化Ventana BenchMark ULTRA PLUS染色系统（Roche Diagnostics, Switzerland）根据制造商建议进行。CK18分析使用Dako Omnis染色系统（Agilent Technologies, CA, USA）根据制造商建议进行。Ki-67 LI、p53和CK18分别使用单克隆抗体SP6（Vitro S.A., Spain）、DO-7（Roche Diagnostics, Switzerland）和DC-10（Vitro S.A., Spain）检测。完成Ki-67、p53和CK18免疫组化反应后，使用Pannoramic 250 FLASH III扫描仪（3DHISTECH, Hungary）将图像数字化。由LUHS病理解剖科诊所的合格病理学家使用3DHISTECH SlideViewer 2.9.0程序并基于WHO内分泌和神经内分泌肿瘤分类对数字化图像进行评估。

评估CK18图像时，免疫组化反应分为阳性（+）和阴性（-）。阳性反应确定弥漫性和局灶性染色模式。根据染色性质，观察到细胞质、核周、纤维小体和环状核周反应（表2）。

Ki-67和p53标志物评估在热点区域（最密集阳性染色区域）进行（表3）。选择扫描质量最佳的热点区域后，评估300个肿瘤细胞核，低于推荐标准。然而，这种方法确保了所有病例的一致性和可行性。评估Ki-67时，细胞核分为“阴性（-）”和“阳性（+）”类别，并计算阳性染色核的百分比。评估p53时，肿瘤细胞核根据核染色颜色、强度和在整个核中的分布分为“阴性（-）”、“弱阳性（+）”、“中度阳性（++）”和“强阳性（+++）”类别。计算所有p53阳性核的百分比并按类别单独划分。形态不清的核不纳入评估。

为计算Ki-67阳性（棕色/深棕色/黑色）核的百分比，阴性核标记为蓝色，阳性核标记为红色。对于p53阳性核，“弱阳性（+）”核标记为黄色，“中度阳性（++）”标记为橙色，“强阳性（+++）”标记为红色。

2.6 统计分析

使用垂体腺瘤全球患病率9%和dbSNP数据库中MEG3 rs4081134（31.4%）和rs7158663（46.9%）的次要等位基因频率，我们计算了在通过逻辑回归中最低AIC选择的最稳健遗传模型下检测关联的统计功效。样本量为120例PitNET患者和220例对照，该研究检测中等遗传效应的功效低于80%，表明未来需要更大样本量的研究来确认这些发现。使用Statistical Package for the Social Sciences, version 29.0 for Windows（SPSS for Windows, version 29.0, USA）进行统计分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验检验测量变量的正态分布假设。当数据不符合正态分布标准时，应用描述性统计如中位数和四分位距（IQR），并使用非参数Mann-Whitney U检验。使用χ2检验分析MEG3 rs4081134和rs7158663单核苷酸变异分布的差异。使用二元逻辑回归分析估计疾病发生的优势比（OR），指示具有95%置信区间（CI）的OR。使用Akaike信息准则（AIC）确定最佳拟合遗传模型，最低AIC值表示最合适的模型。根据2022年WHO内分泌和神经内分泌肿瘤分类，Ki-67结果分为两组：“≤3%”和“>3%”。对于p53，肿瘤细胞核根据核染色颜色、强度和分布分为“阴性（-）”、“弱阳性（+）”、“中度阳性（++）”或“强阳性（+++）”。为客观评估p53染色强度，计算组织评分（H-score）如下：（1 × 弱染色核百分比）+（2 × 中度染色核百分比）+（3 × 强染色核百分比）。为检验统计假设，我们选择显著性水平（p）标准，对SNV分析应用Bonferroni校正，当p值<0.025时确定有统计学显著差异。在其他分析中，统计学显著变化为那些p < 0.05的。

3 结果

病例对照研究涉及340名受试者，分为两组：对照组（n=220）和PitNET患者组（n=120）。受试者组形成后，进行MEG3 rs4081134和rs7158663变异的基因分型。PitNET组由120名受试者组成：男性51名（42.5%），女性69名（57.5%）。对照组由220名受试者组成：男性100名（45.5%），女性120名（54.5%）。受试者的人口统计学数据见表4。

MEG3 rs4081134和rs7158663的基因型和等位基因分布在PitNET组中进行分析并与对照组比较。然而，组间未发现统计学显著差异（表5）。

二元逻辑回归也显示PitNET患者与对照组之间无统计学显著差异（表6）。

在研究组内按性别分层分析所选SNV的基因型和等位基因频率。然而，女性和男性PitNET与对照组之间在基因型和等位基因分布以及二元逻辑回归分析中均无统计学显著差异（表7-9）。

还在微腺瘤和大腺瘤与对照组之间分析了所选SNV的基因型和等位基因频率。然而，微腺瘤/大腺瘤与对照组之间在基因型和等位基因分布以及二元逻辑回归分析中均无统计学显著差异（表10和11）。

还根据PitNET的复发、活性和侵袭性，在PitNET和对照组之间分析了所选SNV的基因型和等位基因频率。然而，有复发、活性和侵袭性PitNET的组与对照组之间在基因型和等位基因分布以及二元逻辑回归分析中均无统计学显著差异（表12和13）。

还根据无复发、非活性和非侵袭性PitNET，在PitNET和对照组之间分析了所选SNV的基因型和等位基因频率。然而，组间无统计学显著差异（表14和15）。

3.1 免疫组织化学

在99例PitNET患者中进行了使用Ki-67、p53和CK18标志物的免疫组化反应。比较PitNET临床特征与p53 H-score时发现了统计学显著差异（表16）。发现大腺瘤的p53 H-score统计学显著高于微腺瘤（中位数（IQR）：27（29.65） vs. 16（12.84），p=0.008）。此外，侵袭性PitNET的p53 H-score统计学显著高于非侵袭性PitNET（中位数（IQR）：27（27.99） vs. 20（19.31），p=0.018）。

比较不同Ki-67 LI免疫组化反应（<3%和>3%）的组，未发现临床PitNET组间有统计学显著差异（表17）。

比较PitNET临床特征组与CK18免疫组化反应类型时发现了统计学显著差异。发现侵袭性PitNET以阴性CK18反应为特征，与非侵袭性PitNET组相比（24（44.4%） vs. 6（13.3%），p < 0.001）。还发现非活性PitNET与功能性活性PitNET相比具有阴性CK18反应（21（42.0%） vs. 9（18.4%），p=0.011）。比较微腺瘤和大腺瘤以及有或无复发的PitNET之间的CK18反应时未发现统计学显著差异（表18）。

比较阴性和阳性CK18免疫组化反应类型之间MEG3 rs4081134和rs7158663变异的分布时，未观察到统计学显著差异（表19）。

比较<3%和>3% Ki-67 LI免疫组化反应组之间MEG3 rs4081134和rs7158663变异的分布时，未观察到统计学显著差异（表20）。

为评估MEG3 rs4081134和rs7158663变异与p53的关联，计算了不同基因型组的p53 H-score。然而，未观察到统计学显著差异（图1和2）。

4 讨论

肿瘤标志物在癌症筛查和早期诊断、预后预测、监测复发和评估治疗反应中已被证明起着至关重要的作用。目前，对新型、高灵敏度和特异性标志物的持续研究是个性化医疗的基石，并显著改善了癌症患者的结局。

我们的研究调查了MEG3 rs7158663和rs4081134变异、Ki-67 LI、p53 H-score和CK18免疫组化反应与PAs临床病理特征的关系。MEG3是一种lncRNA，主要已知参与调节p53肿瘤抑制基因表达。近年来，MEG3及其遗传变异由于其潜在参与肿瘤发生而在科学领域受到显著关注。有趣的是，MEG3 rs7158663变异被发现与肺、结直肠和胃癌的易感性增加相关。根据Wang等人的研究，MEG3 rs7158663变异可能破坏特定miRNA（如hsa-miR-4307和hsa-miR-1265）与MEG3的结合。此类干扰可能影响基因调控机制并 potentially contribute to cancer development。虽然这些关联已在多种恶性肿瘤中得到充分证明，但需要强调的是，MEG3及其变异，特别是rs7158663，在PitNETs背景下的作用尚未得到广泛研究。尽管MEG3在肿瘤抑制中的一般功能正逐渐被揭示，但其在PitNET病理生理学中的参与仍相对未被探索。Wang等人的研究表明，低MEG3表达与较大的PitNET大小（>3 cm）、增加的侵袭性和晚期临床阶段（III-IV）显著相关。此外，MEG3过表达与抑制垂体细胞增殖和诱导凋亡相关。Tang同事进行的一项研究证明了MEG3 lncRNA的肿瘤抑制作用，显示刺激性G蛋白（GNAS）的α亚基突变上调MEG3 lncRNA表达，并与较少侵袭的生长激素分泌型PitNET相关。在我们的研究中，MEG3 rs7158663和rs4081134变异均未显示与PitNETs的任何显著关联。此外，未观察到分析的变异与Ki-67 LI、p53 H-score或CK18免疫组化反应之间的关联。这些发现表明，尽管MEG3变异在其他癌症中具有已确立的相关性，但它们在PitNETs中的作用仍不清楚，需要进一步研究。

Ki-67是另一种在各种癌症中广泛研究的生物标志物。根据2022年WHO神经内分泌肿瘤分类，Ki-67 LI不再用作PitNETs的正式诊断标准，尽管它被认可为侵袭性肿瘤行为的标志物。然而，B?lini?teanu等人的研究证明了催乳素表达与Ki-67 LI之间的显著正相关。根据研究人员，其他垂体激素未显示与增殖率的统计学显著关联。此外，高Ki-67 LI（>3%）与更具侵袭性的肿瘤行为相关，需要更密切的放射学和内分泌学随访。Grimm等人揭示Ki-67增殖指数不能预测PAs的侵袭性或大小。此外，Ki-67 LI未显示与海绵窦侵袭（Knosp分级）的任何显著关联。相反，Yuhan等人的研究表明，功能性PitNET的较高Ki-67指数对应于较低的Knosp分级。另一方面，非功能性PitNET的较高Ki-67指数与较高的Knosp分级相关，表明非功能性PitNET在诊断前可以长得更大和更具侵袭性，允许增殖性肿瘤延伸至海绵窦。然而，最近发表的一项研究强调Ki-67 LI结果高度依赖于使用的特定评估方法。因此，Loughrey等人证明，在1,000个细胞上评分的数字Ki-67 LI显著高于在10,000个细胞上评分，当Ki-67 LI在较少数量的细胞上评估时会导致 substantial margin of error。在我们的研究中，我们采用了不同的方法，使用热点计数法评估Ki-67 LI，旨在靶向肿瘤内最具增殖性和潜在侵袭性的区域。尽管采用了这种聚焦方法，但未发现Ki-67 LI（<3% vs. >3%）组与PitNET临床病理特征（肿瘤大小、侵袭性、复发、功能活性）之间的统计学显著关联。这种缺乏相关性可能反映了PitNETs的生物学异质性，其中像Ki-67这样的增殖标志物 alone might not sufficiently capture the complex mechanisms driving tumor behavior。或者，它可能表明Ki-67 LI，即使通过热点分析评估，在单独使用时预后价值有限。我们还承认我们的Ki-67评估未达到推荐的每样本1,000–5,000个细胞的标准。为解决这一局限性，我们分析了相对较大的队列（99例），并将计数限制在最增殖区域的300个细胞。虽然这种方法可能 slightly overestimate the proliferative fraction，但它提供了所有样本的一致手动评估。

p53是一种负责调节各种应激诱导的抗增殖通路的转录因子。尽管在多种恶性肿瘤中得到广泛研究，但其在PitNETs中的作用仍不清楚。Wang等人揭示miR-219a-2-3p通过调节MDM2/p53轴抑制PitNET细胞增殖并促进凋亡。因此，miR-219a-2-3p在PitNET细胞中显著下调。然而，人工过表达miR-219a-2-3p抑制了PitNET细胞增殖并促进凋亡和p53表达。异常p53表达也已在低分化神经内分泌癌（NECs）中报道，与侵袭性行为和较差预后相关，而高分化NETs通常保留正常p53表达。在我们的研究中，我们发现较高的p53 H-score与侵袭性PitNET相关，表明升高的p53表达可能 contribute to PitNET invasiveness。此外，我们发现较高的p53 H-score与较大的肿瘤大小显著相关，显示增加的p53表达可能 contribute to clinical symptoms related to tumor compression。这些发现表明p53免疫组化评分可作为PitNET患者风险评估的有用工具。将p53 H-score纳入常规临床实践可能有助于识别具有较高侵袭性和侵袭性生长风险的肿瘤。

迄今为止，CK18免疫染色模式与PitNET临床病理特征之间的关系尚未建立。尽管CK18表达已在各种其他恶性肿瘤中得到广泛研究，通常与肿瘤分化、增殖活性和总体预后相关。Yang等人强调，升高的血清CK18水平与较差的乳腺癌预后相关，而高CK18组织表达指示较好的结局。此外，高CK18表达已发现与较大的肿瘤大小、分期和分级相关。Shi等人揭示CK18表达在晚期和转移性乳腺肿瘤中被抑制。此外，CK18缺失发现激活NF-κB/Snail轴，导致乳腺癌耐药蛋白（BCRP）上调。Safadi等人证明CK18表达随肿瘤侵袭性上升。较强的CK18免疫组化染色评分与晚期临床阶段和较大的口腔和口咽鳞状细胞癌侵袭显著相关。此外，升高的CK18表达显示手术切除后肿瘤复发的较高机会。Yin等人的研究表明，前列腺癌中的CK18表达与肿瘤分级呈负相关。较低的CK18染色强度与较高的Gleason评分（>7）相关，指示侵袭性前列腺肿瘤中的CK18下调。在我们的研究中，我们发现侵袭性PitNET与阴性CK18反应相关，与非侵袭性PitNET组相比，显示CK18表达缺失可能与PitNET肿瘤侵袭性相关。此外，我们发现功能性非活性PitNET更可能 demonstrate negative CK18 reactions compared to functionally active PitNET groups，指示CK18下调可能与激素产生缺失相关。与p53一样，这些发现表明CK18免疫染色可作为PitNETs中的实用生物标志物，帮助预测肿瘤侵袭性和功能状态。

5 结论

本研究发现升高的p53 H-score与较大的PitNET大小和侵袭性行为显著相关。假设较高的p53 H-score可能与更侵袭性的PitNET进展相关。此外，阴性CK18染色与非功能性PitNET和侵袭性显著相关。该结果表明CK18表达的缺失可能指示更具侵袭性的肿瘤表型和减少的激素活性。这些发现表明p53表达水平和CK18状态可作为PitNETs中有用的预后工具。

6 局限性

我们通过热点区域计数300个细胞评估了Ki-67标记指数，确保了一致评估。未来具有更大队列和自动化方法的研究可能进一步增强这些发现的稳健性。