综述：根际中的细胞外囊泡：改善作物养分利用效率的靶点？

本综述系统探讨了细胞外囊泡（EVs）作为根际信号传递的新载体，如何通过携带小RNA（sRNAs）、次级代谢物和营养转运蛋白等活性物质，精准调控微生物群落功能，进而提高作物氮磷养分利用效率（NUE），为减少肥料依赖和降低N2O排放的可持续农业育种提供新靶点。

　　

Introduction

根际分泌物在塑造植物-微生物互作中发挥着关键作用。这些分泌物包含多种化合物，从碳水化合物、氨基酸和有机酸等初级代谢物，到次级代谢物、蛋白质、挥发性有机化合物（VOCs）和小RNA（sRNAs）等特殊分子。它们的功能广泛，涉及养分动员、有益微生物招募、病原体防御和植物间通讯。

代谢物的被动扩散是许多初级代谢物（包括VOCs）的既定排泄机制。此外，对于信号分子（如植物激素）还存在更复杂的排泄机制，包括转运蛋白介导的运输，以及在某种情况下的细胞外囊泡（EVs）分泌。这对于需要免受降解或严格调控的生物活性分子（如sRNAs和某些次级代谢物）尤为重要。

在动物和人类中，EVs通过多种途径递送其 cargo，包括网格蛋白或小窝蛋白介导的内吞作用、巨胞饮作用、吞噬作用、脂筏相关摄取，以及在某种情况下的直接膜融合。这些机制使EVs能够有效地将敏感的调控分子运输穿过细胞外环境并进入受体细胞。然而，在植物中，细胞壁的刚性结构对EV的释放构成了物理屏障。有证据表明，局部细胞壁重塑或松动——可能由胁迫或发育线索触发——可能促进EVs进入质外体。蛋白质组学分析表明，植物EVs含有细胞壁修饰酶，如葡聚糖酶和过氧化物酶，表明EVs可能在分泌和转运过程中有助于松动细胞壁。

在此基础上，本文探讨了EVs运输特定调控分子（如sRNAs和次级代谢物）以调节植物-土壤界面微生物互作的潜力。我们特别强调了它们在增强微生物养分动员，进而提高植物养分吸收和养分利用效率方面的潜在作用。

The role of the rhizosphere microbiome in the nutrient use efficiency of plants

根际微生物组通过养分矿化、溶解、转运调节和激素信号等过程，关键地调节植物养分利用效率（NUE）。虽然固氮作用主要在豆科植物中起作用，但涉及微生物类群（如芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）和丛枝菌根真菌（AMF）如不规则根孢囊霉（Rhizophagus irregularis）的更广泛机制在提高NUE方面更为普遍重要。

氮矿化——由腐生细菌和真菌（如链霉菌属（Streptomyces spp.）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）介导——涉及酶促降解有机物，通过蛋白酶和脲酶活性释放铵（NH₄⁺）。这一过程控制着氮周转的速率及其与植物养分需求的同步性。同时，氨氧化细菌（如Nitrosospira）和古菌（如Nitrososphaera）介导硝化作用，影响硝酸盐（NO₃^-）的有效性和根系吸收动态。

磷（P）的有效性通过解磷微生物（PSMs）得到增强， notably 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），它们分泌葡萄糖酸和柠檬酸等有机酸，螯合阳离子并从矿物复合物中释放无机磷酸盐。AMF如不规则根孢囊霉形成广泛的根外菌丝，在根耗竭区以外获取正磷酸盐，并通过菌根磷酸盐转运蛋白途径将其转移给宿主。虽然不规则根孢囊霉研究最为广泛，但其他物种如摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）、幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum）和地表球囊霉（Glomus versiforme）也被证明可以增强养分吸收和土壤稳定性，有时具有作物或环境特异性优势。

微生物对根构型的调节是另一个关键机制。植物根际促生菌（PGPR），包括巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），合成生长素（主要是吲哚-3-乙酸），增加侧根增殖和根毛密度，扩大根系表面积以吸收养分。此外，产生ACC脱氨酶的微生物（如荧光假单胞菌）在养分胁迫下降低乙烯水平，从而促进根伸长和养分觅取效率。

最近的宏基因组研究强调了植物基因型如何影响养分循环微生物的招募。例如，水稻中NRT1.1B介导的NO₃^-信号调节根微生物群组成，有利于参与氮循环的类群，从而增强NUE。

重要的是，新出现的证据表明，EVs在根际提供了一个额外的调控层。在植物中，已证明EVs介导小RNA的跨界转移，突出了它们与微生物进行直接分子通讯的能力。植物EVs还选择性包装特定的小RNA，包括miRNAs、siRNAs和一类独特的10–17 nt“tiny RNAs”，表明具有信号潜力的主动分选。尽管它们在养分循环中的直接作用尚不清楚，但此类 cargo 表明EVs可能将植物信号与微生物功能整合，与NUE相关。与此一致的是，豆科植物根瘤周EVs的蛋白质组学研究发现，约10%的蛋白质与RNA代谢有关，包括DEAD/DEAH-box解旋酶，指出EV介导的RNA转移在早期共生中可能发挥作用。

Extracellular vesicles in the rhizosphere: classical view of plant immunity and pathogen defense

植物主动将EVs从根部释放到周围环境中，这些囊泡的尺寸通常在50到100 nm之间。EVs含有多种生物活性分子，包括蛋白质、脂质、代谢物和RNAs，它们影响植物-微生物相互作用。最近的证据表明，EVs介导跨界RNA干扰（RNAi），将植物来源的小RNA（sRNAs）运输到真菌细胞中，以沉默毒力相关基因。因此，EVs可能代表了调节根际微生物群落的关键载体。

我们目前对EVs的理解大多来自植物免疫研究。研究表明，EVs不仅装载着多样的 cargo，包括sRNAs和RNA结合蛋白（如AGO1和RH37），而且还被真菌和植物细胞主动内化。例如，在系统获得性抗性（SAR）期间从拟南芥分离的EVs激活了免疫基因表达并抑制了真菌孢子形成。这些发现表明，EVs不仅仅是被动载体，还充当主动信号剂，可能放大系统和跨界通讯。

新出现的证据将EV介导的miRNA信号与植物营养和微生物病害抑制联系起来。Liu等人证明，与无机化肥相比，有机肥料显著增强了番茄根中特定miRNA（sly-miR159和sly-miR319c-3p）的分泌。这些通过外泌体样EVs分泌的miRNA有助于抑制土传病原体青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。值得注意的是，sly-miR159还促进了有益微生物，包括链霉菌属（Streptomyces）和芽孢杆菌属（Bacillus）的成员。

尽管已经从各种植物组织（包括叶片、根、花粉、柱头分泌物和种子）中分离出EVs，但它们在植物防御和与微生物相互作用中的功能才刚刚开始被充分阐明。在氮循环的背景下，EVs可以作为调节微生物活性的信使，可能影响氮转化细菌的丰度和活性。然而，尚无研究量化EVs对养分循环的贡献程度，这使其成为未来研究的一个激动人心的方向。

The role of extracellular vesicles for NUE of crops

植物EV蛋白质组学研究在根分泌的EV样本中检测到许多转运蛋白（例如，用于NO₃^-、磷酸盐和NH₄⁺的）、质子ATP酶和水通道蛋白，支持了EVs可能在作物NUE中发挥作用的想法。深入的研究主要集中于豆科及其各自的共生体。根分泌的类黄酮，通过ABC转运蛋白递送，通过诱导细菌结瘤基因来启动共生。

最近的一项研究表明，豆科植物根释放含有小RNA（sRNAs）和肽的EVs，这些可能调节固氮共生。来自Lotus burttii和菜豆（Phaseolus vulgaris）的EVs的蛋白质组学分析显示，约10%的EV相关蛋白质参与RNA代谢，包括与sRNA加工相关的DEAD/DEAH-box RNA解旋酶。这些发现，连同跨界RNA干扰的证据——植物使用EVs将sRNAs递送给其他生物——表明EV介导的sRNA转移可能在早期共生期间调节根瘤菌基因表达。

除了在植物内部营养信号传导中的作用外，几种miRNA，包括miR160、miR167、miR169、miR172和miR396，已被证明可以调节豆科植物的根瘤形成和根瘤菌（Rhizobium）侵染。这强调了它们在养分获取和植物-微生物通讯中的双重作用。将这些miRNA包装到EVs中可能代表了一种复杂的机制，用以协调微生物共生与宿主营养状态。识别提高共生效率的EV相关sRNA可以直接为作物改良策略提供信息。

尽管大多数机制研究都集中在共生系统上，但类似的EV介导过程预计在非豆科根际中运作。在这些系统中，来自根际细菌的EVs已被证明封装了水解酶——如磷酸酶和蛋白酶——这些酶在根表面附近催化有机磷和有机氮的矿化，可能提高根吸收区附近的正磷酸盐和NH₄⁺的局部库。EV cargo 还可能包括铁载体和氧化还原活性分子，能够螯合铁和动员矿物结合的磷，类似于在芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）的许多菌株中发现的解磷微生物过程。尽管植物来源的EVs介导的对此类群体的直接miRNA调控尚未得到证实，但通过EV诱导的微生物群落结构变化进行调节是合理的，值得进一步研究。

此外，高粱、水稻、玉米、臂形草（Brachiaria）属草类和某些豆科植物等植物释放多样的根分泌物代谢物——萜类、苯丙素、苯并恶唑烷酮、醌类——它们作为生物硝化抑制剂（BNIs），抑制氨氧化细菌（AOB）和古菌（AOA）的活性，从而减缓NH₄⁺向NO₃^-的转化。例如，水稻根中的丁香酸通过减少AOB和AOA的丰度，强烈抑制了酸性稻田土壤中的硝化作用和N₂O排放。在玉米中，疏水性化合物如苯并恶唑烷酮HDMBOA和一种名为“zeanone”的新型醌在根分泌物中被鉴定出来，对欧洲亚硝化单胞菌（Nitrosomonas europaea）和其他AOB的半最大抑制浓度（ED₅₀）在低微摩尔范围内。整体机制模型表明，从根释放BNI减少了净氮损失，并且在大多数条件下改善了植物对氮的吸收，如果根分泌的EVs也携带相应的转运蛋白，则效果更佳。

除了BNIs，最近用黄花蒿（Artemisia annua）进行的分根实验表明，异质性的NO₃^-和磷酸盐供应显著增强了养分缺乏根区中次级代谢物青蒿素的分泌，而同质性缺乏则没有。这表明需要局部和系统性养分信号的组合来触发根际中的某些次级代谢物。尽管青蒿素不直接动员氮或磷，但这种分泌物组成的变化可能通过塑造微生物群落结构和活性（包括参与养分转化的生物）间接影响养分循环。该反应是物种和化合物特异性的，因为贯叶连翘（Hypericum perforatum）在类似条件下没有改变其次级代谢物的分泌。

Conclusion and future perspectives

根际中EV介导的信号传导正在成为塑造调节氮循环的微生物群落的一个潜在关键组成部分。通过EVs运输microRNAs（miRNAs）和次级代谢物代表了一种有前景但 largely unexplored 的机制，可以为植物提供影响关键微生物过程（如硝化、反硝化和固氮）的空间和时间精度。

除了它们的细胞内作用，几种miRNA如miR399和miR2111作为移动的长距离信号，在茎和根之间移动，甚至在同种植物之间移动。这些信号调节结瘤和磷酸盐吸收，并通过韧皮部系统性地起作用。它们的流动性强烈表明，EVs可以作为这些调控RNA的载体，跨越细胞边界并可能进入根际，从而能够精确和动态地调节微生物的氮转化活性。

几种关键的miRNA——包括miR160、miR164、miR167、miR169、miR393、miR395、miR399和miR827——通过靶向转录因子、养分转运蛋白和激素信号成分，协调植物对氮和磷限制的反应。这些miRNA调节根发育、养分吸收和衰老等过程，形成了一个响应环境条件的动态调控网络。将这些调控RNA包装到EVs中可以使内部营养信号与根际中的微生物调节同步，为植物提供一个强大的工具来动态塑造微生物活性。

未来的研究应侧重于量化EVs对植物-微生物通讯的实际贡献，阐明EV介导的递送如何与其他运输途径相互作用，并识别直接靶向参与氮循环的微生物基因的植物sRNAs。重要的是，几种miRNA——包括miR165、miR167、miR319、miR396、miR399和miR827——也已被证明在干旱以及氮缺乏和干旱复合胁迫下差异调节，具有 distinct early (7-day) and late (14-day) expression responses。这种时间可塑性表明植物根据胁迫类型和持续时间动态微调其调控miRNA的表达。

来自番茄果实组织的 emerging evidence 为这一假设提供了间接但 compelling 的支持。在盐、干旱和氮缺乏胁迫下，番茄植株不仅增加了EV分泌，而且还选择性调节了miRNA组成，富集了miR162和miR1919，同时耗尽了miR9476。这些变化是胁迫特异性的且具有功能后果：EV cargo 的变化直接改变了肠细胞中的锌转运蛋白基因表达和锌积累。尽管源自果实组织而非根分泌物，但这些发现强烈表明植物可以响应非生物胁迫重编程EV组成——这提出了类似机制在根来源的EVs中运作以调节根际微生物活性的可能性。

如果这些调控miRNA确实被包装到EVs中，植物可能能够对根际中的微生物活性进行时间敏感的调节，适应其影响以应对即时和长期的环境挑战。为了检验这些假设， several methodological and analytical advances are critical——特别是在从土壤环境中分离EVs、表征其 cargo 以及将这些分子与微生物群落中的功能结果联系起来方面。互补的方法，包括宏基因组学和转录组学，可以帮助识别天然倾向于与提高氮利用效率的微生物群落相关联的作物基因型。

与此同时，植物中的EV研究，特别是它们在根际中的作用，面临着 significant bioinformatics and data integration challenges。从复杂的土壤环境中分离和表征EVs是一个主要障碍，因为必须将植物来源的EVs与微生物和无机颗粒区分开。一旦分离，EVs包含高度多样的 cargo——包括蛋白质、脂质、代谢物和RNAs——这需要应用多种组学方法，如蛋白质组学、代谢组学和小RNA测序。整合这些异质数据集以推断EVs的功能作用尤其具有挑战性，特别是在尝试将特定的 cargo 分子（例如miRNAs或次级代谢物）与微生物群落响应相关联时。

在不断变化的环境条件下EV分泌的空间和时间动态进一步复杂化了这项任务。在此背景下，探索潜在空间（latent space）的多变量技术——当与分子途径和细胞过程的机制知识相结合时——可以显著增强数据整合和功能解释。然而，推动该领域发展还需要开发新的方法来研究和量化植物与根际微生物组之间的细胞间通讯和囊泡-细胞信号传导，这些目前仍然知之甚少。

解决这些挑战可以为应用进展奠定基础。总之，整合这些见解可以通过靶向的EV分泌和 cargo 组成来实现对植物-微生物相互作用的精确操纵。此类进展可能为培育能够主动塑造其微生物环境的作物铺平道路，实现更高的NUE、减少肥料依赖和降低温室气体排放——最终为气候智能型和可持续农业做出贡献。