激素预处理的输卵管上皮细胞共培养系统通过激活PI3K-AKT信号通路和代谢重编程提升猪体细胞核移植胚胎发育效率

本研究创新性地建立雌激素（E2）和孕酮（P4）预处理的猪输卵管上皮细胞（EP-OECs）共培养系统，显著提升体细胞核移植（SCNT）胚胎囊胚形成率（达30.5%），并通过单细胞转录组学（SMART-seq2）揭示其通过激活PI3K-AKT信号通路、调控戊糖磷酸途径（PPP）和脂质代谢、降低氧化应激（提升GSH水平）以及精细调节多能性因子（如SOX2）表达等多重机制，为优化猪克隆效率及胚胎体外培养体系提供了重要策略。

　　

引言

体细胞核移植（SCNT）技术通过将分化体细胞的核移植到去核卵母细胞中，使供体基因组重编程以支持全胚胎发育，在转基因动物制备、濒危物种保护及发育机制研究中具有广泛应用。猪因其与人类相似的解剖和生理特征，在农业和生物医学研究中备受关注。然而，猪SCNT效率仍低于小鼠、牛和羊，主要源于核重编程不完全和体外培养条件欠佳，难以模拟体内生理环境。当前培养系统未能充分复制体内环境，可能导致克隆胚胎表观遗传重编程异常。为更好地模拟体内环境，研究者采用共培养策略，其中输卵管上皮细胞（OECs）共培养在犬、人、羊中均显示可促进胚胎发育。OECs分泌蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质和细胞外囊泡等复杂混合物，影响精子获能、透明带重塑和胚胎基因组激活等关键过程。激素预处理（如雌激素E2和孕酮P4）可诱导OECs形态和分泌变化，模拟体内内分泌环境，但其在猪SCNT胚胎中的具体机制尚不明确。

材料与方法

本研究经天津农业大学实验动物伦理委员会批准（编号2025LLSC53）。实验设计包括：从输卵管壶腹部至峡部建立原代OEC细胞系，培养未经处理和处理有E2和P4的OECs（EP-OECs）；通过免疫荧光、Western blot和RT-qPCR表征细胞；共培养EP-OECs和OECs与SCNT胚胎，评估发育潜力（卵裂率、囊胚形成率、孵化率、总细胞数、细胞内ROS和GSH水平）；使用单细胞smart-seq测序阐明共培养系统在胚胎发育中的机制。OECs分离自发情同步化处理的大白母猪，培养后激素处理。SCNT胚胎制备采用屠宰场卵巢，体外成熟后去核和体细胞注射，激活后培养。细胞内ROS和GSH水平使用H2DCFDA和CMF2HC检测。Smart-seq测序在2–4细胞、8细胞和囊胚阶段进行，数据比对至猪基因组Sscrofa11.1，进行KEGG富集分析。统计采用ANOVA，显著性设定为p < 0.05。

结果

表征OECs：与纺锤形猪胎儿成纤维细胞（PFFs）不同，OECs呈多边形且细胞质高度颗粒状。免疫荧光显示OVGP1在OECs中阳性表达，PFFs为阴性。EP-OECs的OVGP1免疫荧光强度和Western blot表达显著高于OECs。RT-qPCR显示EP-OECs中OVGP1、ESR1和PGR mRNA水平显著升高，表明激素处理促进了这些基因的表达。

OEC共培养对SCNT胚胎发育的影响：与对照组相比，EP-OEC组卵裂率显著提高。囊胚形成率在共培养组显著改善，EP-OEC组最高（30.5%），OEC组为24.5%，对照组为18.6%。但囊胚总细胞数无显著差异，表明共培养不影响细胞增殖。

OEC共培养对SCNT胚胎质量的影响：在2–4细胞阶段，OEC和EP-OEC组ROS水平略高（不显著）；在8细胞阶段，EP-OEC组ROS水平显著升高；囊胚阶段无显著差异。GSH水平在2–4和8细胞阶段，EP-OEC和OEC组显著高于对照组；囊胚阶段，EP-OEC组GSH显著低于对照组。表明共培养增强了代谢活性和 redox 平衡能力。

共培养对胚胎基因表达模式的影响：RNA-seq分析发现15,383和13,979个差异表达基因（DEGs）。KEGG富集显示“戊糖磷酸途径”在OEC和EP-OEC组显著富集，OEC共培养上调PGD和GLYCTK。EP-OEC共培养显著扰乱“脂质代谢途径”。EP-OEC组有1,277、1,240和1,229个独有DEGs，其中KAT8、PLIN2和CYP2D6表达升高，SOX2表达降低。KEGG分析显示“PI3K-AKT信号通路”显著富集，PIK3和PDK1在OEC共培养组表达显著升高。

讨论

猪SCNT效率低主要由于核重编程不完全和体外培养条件不生理。OECs共培养通过营养支持和分子分泌调控促进胚胎发育。本研究中，激素预处理增强OECs分泌功能（如OVGP1），提供更生理性的微环境。共培养提高囊胚形成率，但不影响总细胞数，可能与提升GSH水平和 redox 平衡有关。转录组分析显示PPP和脂质代谢途径激活，支持胚胎代谢需求。EP-OEC共培养下调SOX2但促进发育，可能通过其他多能性因子补偿。PI3K-AKT通路激活在8细胞阶段显著，可能促进细胞增殖和分化。这些机制共同模拟体内输卵管环境，提升胚胎发育能力。但研究缺乏植入后发育数据，需进一步体内验证。

结论

OECs共培养特别是E2和P4预处理，通过增强OVGP1表达、优化培养微环境，显著提高猪SCNT胚胎体外发育能力。共培养提升代谢活性和GSH水平，维持 redox 平衡。转录组显示PPP、脂质代谢和PI3K-AKT通路激活，以及多能性因子调控。OEC/EP-OEC共培养激活PI3K-AKT信号通路是促进胚胎发育的关键机制。