超加工食品摄入与系统性硬化症患者胃肠道症状加重及肠道菌群改变的相关性研究

本研究首次揭示系统性硬化症（SSc）患者中超加工食品（UPF）的高摄入量与胃肠道（GI）症状加剧及特定肠道菌群物种丰度变化显著相关，为通过饮食干预（如限制UPF）改善SSc患者GI症状及生活质量提供了重要理论依据。

　　

1 引言

系统性硬化症（Systemic Sclerosis, SSc）是一种复杂的自身免疫性疾病，以慢性炎症和多器官系统纤维化为特征，其中胃肠道是最常受累的内脏器官。研究表明，高达90%的SSc患者会出现GI功能障碍，最常见的是食管疾病。下GI道受累（如胃轻瘫、便秘或大便失禁）虽较少见，但这些症状不仅导致营养不良和不良健康结局，还显著影响生活质量和情绪健康。

下GI道功能障碍的病理生理机制尚不明确，但新兴证据表明肠道微生物组是关键因素。特别是在早期SSc患者中观察到的独特肠道菌群改变（即菌群失调）提示， dysbiosis可能是疾病进展的促成因素。此外，特定的SSc表现（如间质性肺病（ILD）和小肠细菌过度生长（SIBO））与SSc中独特的微生物谱相关。这些变化涉及物种多样性减少和致病菌物种过度代表，也在其他与系统性慢性炎症相关的疾病中观察到，如系统性红斑狼疮（SLE）、炎症性肠病（IBD）和2型糖尿病。向致病菌的转变被认为会引发肠道通透性增加、免疫失调和系统性炎症；然而，驱动这些微生物改变的因素可能是多方面的。

饮食是微生物组的已知调节因子，饮食变化可在几天内诱导微生物转变。超加工食品（Ultra-Processed Food, UPF）的消费（即完全或大部分由食品提取物、衍生物和添加剂制成的工业配方，设计为超可口）特别与菌群失调和细菌多样性减少相关。UPF消费增加与多种慢性疾病相关，包括代谢综合征、心血管疾病、癌症、抑郁症、IBD和肾功能下降。

鉴于西方饮食中对UPF的依赖日益增加，理解其对微生物组和人类健康及疾病的潜在后果是一个日益增长的关注领域。然而，尚无先前研究调查UPF消费对SSc患者GI症状和GI微生物组的影响。本研究旨在检验以下假设：（1）UPF消费增加与SSc患者GI症状增加相关；（2）物种丰度的改变与UPF消费增加和GI症状严重程度相关。在旨在为未来研究生成假设的探索性分析中，我们调查了UPF消费是否介导肠道微生物组与GI症状严重程度之间的关联。本研究结果可能为未来制定基于证据的营养指南以管理SSc中的GI疾病提供信息。

2 材料与方法

2.1 研究参与者

参与者是从2014年1月至2022年11月从加州大学洛杉矶分校（UCLA）硬皮病中心诊所连续招募的患者。纳入标准为成人患者（年龄≥18岁），符合2013年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟SSc分类标准，任何疾病持续时间。排除标准包括存在合并的GI疾病，如IBD、GI恶性肿瘤或乳糜泻。如果参与者无法在粪便收集前至少三周停止使用抗生素，或在过去一年中使用了超过2个疗程的抗生素，也被排除。患者可以继续使用抗酸剂、组胺H2受体拮抗剂、免疫调节药物和质子泵抑制剂（PPI），以最小化不必要的发病率，但必须在粪便收集前至少一周停止使用泻药、促动力剂和抗腹泻药物。

参与者的临床特征通过图表审查获得。SSc疾病持续时间基于从首次非雷诺症状发作到粪便收集日期的时间。药物史由参与者自我报告，并由研究团队使用电子医疗记录独立验证。免疫调节使用定义为从疾病发作到粪便收集日期任何免疫调节药物的使用。ILD的存在由胸部高分辨率计算机断层扫描（HRCT）确定。其他疾病特征的存在，如SIBO，基于医师诊断确定。

UCLA机构审查委员会批准了研究方案，并获得了每位参与者的书面知情同意。

2.2 样本收集、基因测序和微生物组分析

患者使用先前发表的家庭收集方法提供粪便样本。样本在等待处理和分析时冷冻并存储在-80°C。使用Illumina NovaSeq 6000进行鸟枪法宏基因组学，目标深度为每个样本1000万条150x2序列。鸟枪法读数输入MetaPhIAn4进行物种分类鉴定以进行组成分析，随后进行中心对数比转换。样本被过滤以保留至少10%非零计数的物种，最终分析包含257个物种。

2.3 UPF消费和GI症状评估

2.3.1 UPF消费

在粪便收集当天，所有参与者完成了饮食史问卷II（DHQ-2），这是一份有效的142项食物频率问卷，评估过去四周内特定食物、饮料和调味品的摄入量。对于每个项目，患者报告份量和消费频率。每个项目的摄入量通过将项目的典型份量（克）乘以其报告的每周消费频率来计算，以创建克/周的连续变量。每个项目的份量重量来自国家癌症研究所的相关营养数据库。使用NOVA食物分类标准，该问卷中的54个项目被识别为超加工或第4组。由于模糊性无法计算份量的选定食物（N=17）（如人造黄油和奶油奶酪）被排除。这些项目的总和被计算以确定参与者的总UPF消费量（克/周）。然后根据UPF消费中值将参与者分为低或高UPF消费组。

2.3.2 GI症状严重程度

为评估GI症状严重程度，所有参与者还在粪便收集当天完成了UCLA硬皮病临床试验联盟胃肠道工具（GIT 2.0）。GIT 2.0是一份自我报告的问卷，测量SSc患者的GI症状严重程度和生活质量。它包含34个项目，跨越7个量表（反流、腹胀、大便失禁、腹泻、社会功能、情绪健康和便秘）。总分平均6个量表，评分从0-3，较高分数表示更严重的SSc-GI症状和GI相关生活质量。

2.4 统计分析

参与者特征使用均值和标准差总结连续变量，使用频率和百分比总结分类数据。此外，应用独立t检验和Fisher精确检验测试基于中值的低和高UPF亚组之间这些特征的差异。使用香农多样性指数比较低和高UPF亚组之间微生物群落的物种丰富度和均匀性，而使用稳健主成分分析（rPCA）比较低和高UPF亚组之间的全局组成差异（即β多样性）。

2.4.1 关联分析

使用一般线性模型（GLMs）测试257个物种丰度与GI症状严重程度和UPF消费（连续测量）之间的关联，控制先前研究中已知影响肠道微生物组成的因素。这些因素先验确定，包括体重指数（BMI）、当前PPI使用、当前补充益生菌使用、当前或既往免疫调节治疗以及SIBO的存在。我们考虑p<0.05作为报告阈值。我们报告非标准化beta估计（b）、标准误差和标准化beta（β）作为效应大小估计。

2.4.2 中介分析

为检查UPF消费对预测变量（即特定细菌物种）与结果变量（即GI症状严重程度）之间关联的中介（间接）效应，我们应用探索性中介分析，使用通过结构方程建模实现的同步线性回归方程。基于上述分析与GI症状严重程度显著相关（p<0.05）的细菌物种被包括在中介分析中。所有模型调整了上述协变量（如BMI、当前PPI使用、当前补充益生菌使用、当前或既往免疫调节治疗以及SIBO的存在）。显著性水平设定为p<0.05。报告了间接效应的标准化β和置信区间。所有分析使用R进行。中介分析使用lavaan进行。使用semhelpinghands包中的standardizedSolution_boot_ci()函数获得间接效应的自举95%百分位置信区间。对于间接效应，不包含零的置信区间表明统计显著的中介。

3 结果

3.1 参与者特征

在研究的65名SSc患者中，大多数为女性（84.6%）。平均年龄为53.83 ± 13.19岁，平均BMI为25.25 ± 4.75。UPF消费中值为2395.82克/周，而平均UPF消费为2782.44克/周，范围174.55–9231.91克/周（SD=2165.22）。队列的平均GIT 2.0得分为0.55（SD=0.56）。中位疾病持续时间为7.16年，范围0.41–44.34年。55.3%（N=36）的参与者在HRCT上观察到ILD，29.2%（N=19）有SIBO。大多数患者（84.6%；N=55）报告当前或既往使用免疫调节药物。

低和高UPF消费队列之间未观察到患者特征的统计显著差异。此外，两个UPF亚组之间未观察到α多样性（Kruskal-Wallis H=0.45；p=0.50）或β多样性（p=0.90）的统计显著差异。

3.2 较高的UPF消费与更严重的GI症状相关

在整个队列中，在我们的多变量模型中，UPF消费增加与GI症状增加显著相关（β=0.34；p<0.01）。

3.3 特定细菌物种与UPF消费相关

在识别的257个物种中，10个细菌物种的丰度基于UPF消费显著改变。调整协变量后，5个细菌物种仍与UPF消费显著相关。UPF消费增加与Butyricimonas SGB15260（β=0.29；p<0.02）、Limosilactobacillus fermentum（β=0.32；p<0.01）、Dysosmobacter NSJ60（β=0.28；p<0.03）和Dialister hominis（β=0.26；p<0.04）的丰度增加相关。相反，UPF消费增加与Faecalicatena fissicatena（β= -0.36；p<0.01）的丰度减少相关。

3.4 特定细菌物种与GI症状严重程度相关

在识别的257个物种中，6个细菌物种的丰度在调整上述协变量后与GI症状严重程度显著相关。例如，Bifidobacterium pseudocatenulatum（β=0.23；p<0.04）、Ruminococcus callidus（β=0.25；p<0.03）、GGB9719 SGB15272（β=0.23；p<0.05）、Dysosmobacter spNSJ60（β=0.26；p<0.02）的丰度与GI症状严重程度正相关；而Coprococcus catus（β= -0.28；p<0.02）和GGB9713 SGB15249（β= -0.28；p<0.02）的丰度与GI症状严重程度负相关。值得注意的是，Dysosmobacter NSJ60与UPF摄入和GIT 2.0得分均显著相关。

3.5 UPF消费是否介导GI微生物物种与GI症状之间的关系？

接下来，我们通过中介分析测试了UPF消费是否介导特定肠道微生物物种（预测变量）对GI症状严重程度（结果）的影响。在此分析中，被识别为与GI症状显著相关的6个细菌物种作为预测变量输入模型。虽然中介分析揭示了几个直接效应，但没有证据表明UPF消费统计上介导了物种与GI症状得分之间的观察到的关联。换句话说，GI物种与GI症状之间的关系似乎不是由UPF摄入介导的，尽管UPF摄入增加与更严重的GI症状相关。

4 讨论

GI受累发生在大多数SSc患者中，目前没有疾病修饰疗法可用于预防这种令人困扰的SSc表现的进展。患者经常进行饮食修改以尝试改善其GI症状；然而，该疾病的营养研究稀少，目前没有基于证据的关于SSc饮食的建议。本研究首次证明SSc中UPF消费与GI症状之间的关系。首先，我们发现报告较高UPF消费的SSc患者比较低UPF消费的患者报告增加的GI症状。其次，我们发现特定细菌物种与UPF消费和GI症状相关。最后，我们发现UPF消费和GI症状直接相关，表明GI微生物组以外的因素也可能影响这种关系。总之，本研究结果表明，降低UPF消费可能潜在地帮助改善SSc患者的GI症状。

本SSc队列中的平均UPF消费为2782.44克/周，这与发达国家其他研究报告的数据相似，包括在巴西（约2562克/周）和西班牙（约2692克/周）进行的研究。然而，本队列中观察到的UPF消费与在加拿大魁北克进行的研究（约1575克/周）相比增加。在本SSc队列中高UPF消费组的患者中，平均摄入量为4384.34克/周。这再次与上述巴西和西班牙队列相当，其中高UPF消费组的平均摄入量分别为5145克/周和4448克/周。

在我们的多变量模型中，UPF消费增加也与GI症状增加显著相关。这些发现与其他GI疾病的研究一致，包括肠易激综合征（IBS）和功能性便秘。UPF影响GI症状的潜在机制尚未完全理解。然而，UPF食物的低纤维含量可能潜在地恶化症状，如便秘。此外，研究表明，UPF中发现的添加剂，如人工甜味剂和乳化剂，可以影响肠道屏障的完整性，导致肠道通透性增加、肠上皮细胞凋亡和黏液产生受损，所有这些都可能促成细菌易位和增加局部和系统性炎症。

在SSc的背景下，一种与菌群失调相关的疾病状态，UPF消费增加可能进一步加剧GI微生物组组成的改变。Cueva-Sierra及其同事证明，消费较高量UPF的男性α多样性减少，并且新兴研究报告暴露于UPF成分（如人工甜味剂和乳化剂）后细菌多样性减少。在本研究中，我们未检测到高和低UPF亚组之间α或β多样性的显著差异；然而，我们基于中值对亚组进行二分。由于没有“高UPF”摄入的有效定义，我们的二分程序可能掩盖了当使用不同阈值定义亚组时可能明显的关联。Cueva-Sierra及其同事的研究将高UPF摄入定义为每天5份或更多。由于我们的研究捕获了过去四周的UPF摄入，我们无法在本文中验证他们的方法。

然而，我们在包括UPF摄入作为连续测量变量的多变量模型中检测到物种水平的差异。例如，我们发现Limosilactobacillus（先前命名为Lactobacillus）fermentum的相对丰度增加与高UPF摄入相关。这可能部分归因于我们的研究人群，因为先前研究证明，与健康对照相比，SSc患者中共生Limosilactobacillus的丰度增加。

Bifidobacterium pseudocatenulatum和Ruminococcus callidus也与GI症状严重程度正相关。Bifidobacterium属的丰度在调查SSc患者微生物组的先前研究中增加，并且它在女性和高UPF饮食中也增加。Ruminococcus，一个传统上被视为致病菌的属，在SSc患者的先前研究中丰度增加。重要的是，这是第一个报告物种水平与SSc中GI症状关联的研究，因为先前研究仅调查属水平关联。因此，这些关联需要在其他队列中复制。

虽然我们的中介分析未证明UPF消费介导物种丰度与GI症状之间的关系，但可以想象我们的研究在检测此探索性分析中的显著间接效应方面效力不足。也可能我们的中介分析未考虑所有可能的混杂因素，尽管我们确实尝试调整那些先前研究中一致发现影响GI微生物组成的变量。

我们的研究应在某些限制的背景下考虑。首先，该研究是横断面的，因此观察到的关系可能不是因果的或随时间持续。需要未来的前瞻性研究；特别是，评估限制UPF摄入对SSc-GI症状随时间进展的影响的对照研究。其次，这是一个单中心研究，因此结果可能不能推广到其他SSc患者人群，特别是那些居住在UPF消费有限的国家的患者。第三，我们的样本量相对较小；然而，我们观察到与先前研究报告一致的显著关联，表明发现不太可能仅由于偶然性。第四，用于评估UPF摄入的问卷基于患者报告，可能遭受回忆偏差。此外，我们必须排除某些可能被视为UPF的食物，当它们的精确UPF量无法估计时。未来使用每日电子食物日记的前瞻性研究可以最小化回忆偏差的风险。

本研究具有重要优势。首先，它是第一个使用鸟枪法宏基因组学获得SSc患者GI微生物组的物种水平分辨率并调查物种丰度与GI症状之间关联的研究。SSc中先前的微生物组研究主要利用16S测序，产生限于属水平的微生物群数据。鉴于一个属内的一些物种可以作为共生生物而其他作为致病菌的事实，我们的研究代表了该领域的重要进展。其次，我们调整了分析以考虑已知影响结肠微生物群的潜在混杂因素，包括益生菌和免疫调节药物。最后，我们通过三次验证患者药物列表确保我们的患者在粪便收集前至少3周停止使用药物，如抗生素。

总之，这是第一个报告SSc患者中UPF消费与GI症状之间关系的研究。发现表明，UPF摄入与GI症状之间的关系部分由GI微生物组的改变调节。结果还表明，最小化UPF消费可能潜在地改善SSc患者的GI症状，尽管需要未来的前瞻性对照试验来检验这一假设。鉴于UPF摄入在一般人群中与多种不良健康结局相关，限制UPF摄入有潜力改善SSc患者的生活质量。