黄瓜收获前穗发芽主效QTL qPHS4.1精细定位与关键基因CsDOG1的功能解析

本研究通过精细定位黄瓜收获前穗发芽（PHS）主效QTL qPHS4.1，成功克隆了控制种子休眠的关键基因CsDOG1（Delay of Germination 1）。该基因编码含DOG1结构域的核定位蛋白，其3-bp缺失突变导致氨基酸缺失，显著降低种子休眠性并引发PHS。利用CRISPR/Cas9基因编辑验证了CsDOG1的功能缺失突变体表现出极端PHS敏感性。研究为黄瓜抗PHS育种提供了重要基因资源和理论依据。

　　

引言

黄瓜（Cucumis sativus L.）作为全球广泛种植的重要经济作物，其种子质量直接影响农业生产效益。收获前穗发芽（Pre-harvest sprouting, PHS）是指种子在母体果实内提前萌发的现象，严重降低种子活力和商业价值。PHS与种子休眠存在动态关联，高休眠性可维持种子休眠状态直至适宜萌发条件，而低休眠性则导致PHS敏感。尽管在拟南芥、水稻和小麦等作物中已克隆多个PHS相关基因，但黄瓜PHS的遗传机制尚未明确。前期研究通过QTL定位在黄瓜4号染色体发现主效QTL qPHS4.1，但其候选基因和分子机制仍需深入解析。

材料与方法

研究选用高感PHS自交系P60和高抗自交系Q12作为亲本，通过四次回交和标记辅助选择构建近等基因系（NILs）qPHS4.1^P60和qPHS4.1^Q12。利用BC₄F₂和BC₄F₃群体进行精细定位，开发13个InDel标记和Hi-SNP高通量分型技术筛选重组单株。通过表型评价、基因克隆、表达分析、亚细胞定位和CRISPR/Cas9基因编辑等功能验证手段解析候选基因功能。

结果

群体构建与表型验证

NILs表型分析表明，qPHS4.1^P60系PHS率达63.34%，与供体亲本P60（70.40%）无显著差异，而qPHS4.1^Q12系仅2.03%，与轮回亲本Q12（0%）表型一致，证实qPHS4.1为控制PHS的主效QTL。

精细定位与候选基因鉴定

通过3190株BC₄F₂群体筛选187株重组单株，将qPHS4.1缩小至69.34 kb区间（InDel-21至SNP-16之间），解释表型变异38.8%。该区间包含8个基因，其中CsaV3_4G032930编码含DOG1结构域蛋白，命名为CsDOG1。序列分析发现P60中该基因第二外显子存在3-bp缺失（命名为Csdog1），导致天冬酰胺残基缺失。

表达模式与启动子分析

qRT-PCR显示CsDOG1严格特异性表达于种子组织，营养器官中几乎不表达。种子发育过程中，表达量在32 DAP达峰值后下降。P60种子中CsDOG1表达显著高于Q12，但萌发种子中表达急剧下调。启动子序列在亲本间完全保守，含有种子特异性顺式元件（GATA-box、Canbnnapa、AACAcoreosglub1）和ABA响应元件（ABREs）。

亚细胞定位与功能验证

亚细胞定位显示CsDOG1-GFP融合蛋白主要定位于细胞核。通过CRISPR/Cas9编辑Q12背景下的CsDOG1基因，获得三个纯合突变体系（Csdog1 #1、#2、#3），其PHS率均超过75%，显著高于野生型Q12（0%），证实CsDOG1功能缺失导致PHS敏感性。

讨论

本研究通过精细定位和功能验证证实CsDOG1是qPHS4.1位点的因果基因。CsDOG1作为种子特异性表达的核蛋白，其功能缺失突变导致种子休眠减弱和PHS发生。与拟南芥DOG1类似，CsDOG1可能通过调控ABA/GA平衡参与休眠建立。启动子中的ABRE元件和种子特异性 motifs 提示其表达受发育和激素信号协同调控。该研究为黄瓜抗PHS育种提供了关键靶点和遗传资源。