高压均质技术（HPH）提升石莼（Ulva sp.）蛋白质提取效率及其营养与功能特性研究

本综述系统探讨了高压均质技术（HPH）在石莼（Ulva sp.）蛋白质富集提取中的应用及其对营养成分分布、理化特性和生物活性的影响。研究表明，HPH在1000 bar条件下可显著提高蛋白质回收率（60.0%），有效分离硫酸化多糖（ulvan）与蛋白质组分，并保留高比例必需氨基酸（EAA，占42%）。该技术为海藻蛋白的高效、可持续提取提供了新策略，对食品工业与营养健康领域具有重要价值。

　　

2 材料与方法

2.1 培养与采收

实验所用石莼（Ulva sp.）由法国布列塔尼Plouguerneau的France Haliotis公司提供。藻株在70升水箱中培养21天，使用过滤海水，于2024年8月24日采收。采收后，海藻经海水冲洗、34°C过夜干燥、真空密封、冷冻干燥，研磨至500 μm以下，并于4°C储存一周备用。该公司生产过程符合法国法规认证。

2.2 高压均质处理

使用实验室两级高压均质机（PandaPlus 2000, GEA Niro Soavi）进行处理。将3克干燥石莼粉末分散于300毫升去离子水中，制成1%（w/v）悬浮液。悬浮液以9 L·h?1的流速泵入均质机，在20°C下处理，采用集成冷却系统防止过热。样品在0（对照）、600、800和1000 bar压力下处理5个循环，每个条件做三次重复。

均质后，悬浮液在-25°C冷冻一周，解冻后在10°C下以8500 g离心20分钟，立即将残渣和上清液在4°C储存，并过夜冷冻干燥。提取产率按干样重量百分比计算。

2.3 生化成分分析

2.3.1 干物质与灰分含量

矿物质含量通过煅烧法测定。将100毫克海藻粉末在585°C的马弗炉中煅烧2小时，最终质量表示为干重百分比（d.w.）。

2.3.2 生化分析前水解

取5毫克干燥石莼粉末，与1毫升蒸馏水混合，在100°C、1000 rpm下孵育2小时，收集上清液。剩余沉淀用1毫升1 M HCl进行第二次提取，同样条件孵育2小时。上清液合并后用1毫升1 M NaOH中和。沉淀再悬浮于1毫升5 M NaOH中，孵育后收集上清液，用5 M HCl调至pH 8，与之前上清液合并。所有化学分析均做三次重复。

2.3.3 碳水化合物

总糖含量采用DuBois等（1956）的苯酚-硫酸法测定。使用葡萄糖作为标准品，浓度范围为20-100 μg mL?1，在490 nm读取吸光度。

淀粉含量使用总淀粉测定试剂盒（Megazyme）测定。样品经80%乙醇洗涤去除游离葡萄糖，用2 M KOH在37°C孵育30分钟，中和后经酶水解，释放的葡萄糖用GOD-POD试剂在510 nm定量。

单糖组成通过高效阴离子交换色谱（HPAEC-PAD）分析。样品在1 M HCl中100°C水解48小时，使用CarboPac PA-1柱，以NaOH和NaOAc梯度洗脱，检测单糖如甘露醇、岩藻糖、葡萄糖胺、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、核糖和葡萄糖醛酸。

2.3.4 硫酸基含量

采用Azure A比色法测定。使用硫酸葡聚糖作为标准品（0-100 μg mL?1），在535 nm测量吸光度。

2.3.5 糖醛酸

使用Blumenkrantz和Asboe-Hansen（1973）修改的方法。样品与磺胺酸和四硼酸钠反应，加入间羟基二苯（MHDP）后，在525 nm测量吸光度。葡萄糖醛酸用作标准品。

2.3.6 氨基酸与蛋白质分析

氨基酸组成通过气相酸水解后使用HPLC分析。样品用DL-正缬氨酸作为内标，经AccQ-Tag Ultra衍生化试剂盒处理，在C18柱上分离，UV 260 nm检测。

总蛋白质含量使用BCA法测定。样品与Pierce BCA试剂反应，在37°C孵育30分钟，562 nm读取吸光度，BSA作为标准品。

2.3.7 酚类含量

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（TPC）。样品与Folin-Ciocalteu试剂和Na₂CO₃反应，在760 nm测量吸光度，根皮酚用作标准品。

2.4 物理化学分析

2.4.1 傅里叶变换红外光谱分析

使用Lumos FTIR光谱仪记录光谱。样品直接置于采样装置中，在500-4000 cm?1范围内以4 cm?1分辨率和128次扫描进行透射模式测量。背景光谱为空气。

2.4.3 粒度分析

使用激光衍射粒度分析仪测定颗粒大小分布。样品分散在含0.1%（w/v）蒸馏水中，防止聚集，在20°C下分析，结果以体积加权平均直径（D）和粒度分布曲线表示。

2.5 生物活性

2.5.1 抗氧化活性

• DPPH法：基于Guo等（2012）修改的方法。样品与DPPH溶液反应，在517 nm测量吸光度，计算抑制百分比。IC₅₀通过剂量-反应曲线回归确定。

• FRAP法：采用Shahwar等（2012）的方法。样品与FRAP试剂反应，在593 nm测量吸光度，Trolox作为标准品。

2.6 统计分析

使用R软件进行统计分析。数据经Shapiro检验（正态性）和Levene检验（方差齐性）后，采用参数ANOVA或非参数Kruskal-Wallis和Wilcoxon-Mann-Whitney检验，随后进行HSD Tukey或Dunn检验。显著性阈值α < 0.05。

3 结果

3.1 石莼原料的生化组成

石莼原料主要由矿物质（38.1 ± 0.1% d.w.）、糖类（14.3 ± 1.2% d.w.）和淀粉（9.8 ± 3.9% d.w.）组成。硫酸基和糖醛酸分别占5.7 ± 0.8% d.w.和1.5 ± 0.2% d.w.。酚类含量较低（0.3 ± 0.1% d.w.）。单糖以葡萄糖（6.20 ± 0.3% d.w.）、鼠李糖（3.60 ± 0.2% d.w.）、葡萄糖醛酸（3.2 ± 0.2% d.w.）、木糖（0.35 ± 0.02% d.w.）和核糖（0.23 ± 0.0% d.w.）为主。

BCA法测得的蛋白质含量为7.2 ± 0.6% d.w.，而氨基酸分析结果为4.1 ± 0.1% d.w.。必需氨基酸（EAA）占总氨基酸的38.9 ± 0.1%，非必需氨基酸（NEAA）包括丝氨酸（6.2 ± 0.1%）、丙氨酸（10.8 ± 0.0%）和半胱氨酸（0.8 ± 0.0%）。与牛奶蛋白相比，石莼在苏氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸方面含量较高，但天冬氨酸、牛磺酸和酪氨酸较低。EAA/NEAA比值为0.6 ± 0.0%，低于牛奶蛋白（0.8 ± 0.0%）。

3.2 高压均质的影响

3.2.1 干物质和蛋白质提取产率

压力显著影响干物质分布。在0 bar时，上清液、残渣和损失分别为42.4 ± 2.4%、45.9 ± 4.1%和11.6 ± 6.5%。随着压力增加，上清液干物质比例升高，残渣比例降低，损失无显著变化。

蛋白质分布也受压力影响。在0 bar时，上清液、残渣和损失分别为10.8 ± 0.1%、73.2 ± 5.2%和16.0 ± 5.1%。600 bar时，上清液蛋白质升至18.5 ± 6.6%，残渣降至51.8 ± 4.2%，损失增至29.7 ± 5.9%。800 bar时，残渣蛋白质进一步降至44.6 ± 1.7%，损失达41.5 ± 1.7%。1000 bar时，残渣蛋白质回升至58.2 ± 4.9%。压力对蛋白质损失无显著影响，但上清液和残渣间差异显著。

3.1.1 HPH提取物的生化组成

HPH处理后，化合物浓度较原料提高。总酚含量在800 bar残渣中最高（0.6 ± 0.1% d.w.）。中性糖在残渣中显著增加（52.7 ± 4.5% d.w.）。糖醛酸在1000 bar上清液中达28.6 ± 4.5% d.w.。单糖分析显示葡萄糖在残渣中占主导，随压力增加而减少。淀粉在残渣中含量较高，随压力增加而降低。岩藻糖、木糖和葡萄糖醛酸在上清液中富集。硫酸基在1000 bar上清液中最高（23.2 ± 4.9% d.w.）。这些结果表明HPH有效分离了ulvan（上清液）与其他糖类（残渣）。

氨基酸组成显示，残渣富含谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸，上清液富含苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。残渣中EAA比例稳定在40%左右，上清液中较低（28.3-33.4%）。1000 bar时残渣总氨基酸含量最高（7.8 ± 0.3% d.w.）。蛋氨酸在600 bar残渣中最高（1.20 ± 0.1%），亮氨酸和缬氨酸随压力增加而增加。

3.1.2 物理化学分析

FT-IR光谱证实了组分的分离。残渣光谱在1656、1550和1165 cm?1有高强度谱带，对应酰胺N-H弯曲振动和羧基对称伸缩振动。上清液光谱在669、797、991、1163、1263和1434 cm?1有特征谱带，表明ulvan成分的存在，如糖苷键连接和硫酸基团。

粒度分析显示，HPH处理后颗粒尺寸从500 μm显著减小至100 μm（p < 0.05）。

3.1.3 生物活性

DPPH法未检测到显著抗氧化活性。FRAP法显示残渣的抗氧化能力显著高于上清液（p < 0.05），但压力无显著影响。原料的抗氧化能力高于牛奶蛋白。细胞毒性试验表明，在测试浓度范围内，样品对Vero细胞无毒性作用。

4 讨论

4.1 原料组成

石莼的生化组成受物种、时间动态、非生物因素和培养参数影响。蛋白质含量变异大（4-32% d.w.），本研究结果处于较低范围，可能与生长期的高光合和呼吸速率有关。BCA法可能高估蛋白质 due to glucose interference。氨基酸 profile 显示石莼富含EAA，与大豆相当。灰分含量（38%）与文献一致（15-52% d.w.）。碳水化合物以ulvan和纤维素为主，单糖以葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸为主。淀粉含量为8.8% d.w.，处于预期范围内。Ulvan难以被人类酶消化，需与蛋白质分离以提高生物利用度。

4.2 HPH后干物质提取产率

HPH提取产率在残渣和上清液中分别为29.8-45.9% d.w.和42.4-50.1% d.w.。与其他提取方法（如超声波、酶辅助）相比，HPH提供了更高效的细胞 disruption。

4.3 细胞壁破碎与生化组成

HPH增强了蛋白质提取，有效分离了ulvan（上清液）与蛋白质、淀粉和纤维素（残渣）。FT-IR证实了多糖和蛋白质的分离，光谱变化表明压力诱导了细胞壁结构破坏。

4.4 蛋白质与氨基酸

HPH提高了蛋白质提取效率，残渣蛋白质产率随压力增加。氨基酸分布显示残渣富含EAA，营养价值高。与其他高压技术（如HHP、PEF）相比，HPH在蛋白质回收方面表现优异。氨基酸组成以谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸为主，与文献一致。

4.5 物理化学特性

HPH显著减小了颗粒 size，提高了比表面积，有利于后续应用。

4.6 生物活性

抗氧化活性主要存在于残渣， due to 蛋白质、淀粉和葡萄糖。Ulvan具有免疫调节、抗氧化、抗病毒和抗癌活性。蛋白质本身也具有抗氧化 properties。石莼组分在食品、化妆品和生物精炼中有广泛应用潜力。

5 结论

HPH是一种有效的石莼生物质分馏方法，可在环境温度下短时间处理。离心后，ulvan和矿物质溶于上清液，而蛋白质、淀粉和葡萄糖主要留在残渣中。1000 bar时提取产率最高，残渣具有作为食品营养补充剂的潜力。未来研究将探索发酵处理以增强蛋白质释放，并评估细胞毒性和蛋白质消化率。