基于转录组测序解析线粒体相关关键基因SHANK2与TGM2在原发性胆汁性胆管炎（PBC）中的作用机制及临床意义

本研究基于转录组测序数据，通过整合差异表达分析、加权基因共表达网络（WGCNA）及机器学习算法（LASSO/SVM-RFE），首次鉴定SHANK2和TGM2为原发性胆汁性胆管炎（PBC）中线粒体相关关键基因（MRGs）。二者在PBC患者肝组织及外周血中显著高表达（AUC>0.7），功能富集于免疫代谢通路（如B/T细胞受体信号通路、氧化磷酸化），并参与免疫细胞浸润调控。实验验证证实其蛋白/mRNA表达与病理分期正相关，提示其作为诊断生物标志物和靶向治疗策略的潜力。

　　

引言

原发性胆汁性胆管炎（Primary Biliary Cholangitis, PBC）是一种慢性自身免疫性肝病，以进行性肝内小胆管破坏为特征，最终导致肝纤维化和肝硬化。线粒体功能障碍（Mitochondrial Dysfunction）被认为在PBC发病机制中起关键作用，尤其是针对线粒体抗原（如PDC-E2）的自身免疫反应。然而，线粒体相关基因（Mitochondria-Related Genes, MRGs）在PBC中的具体作用尚不明确。本研究旨在通过整合转录组测序数据和生物信息学分析，鉴定PBC中关键MRGs，并探索其诊断价值、功能机制及临床意义。

材料与方法

研究收集了昆明医科大学第二附属医院2020年1月至2024年12月的肝组织和外周血样本，包括40例PBC患者和40例非PBC对照的肝活检样本，以及15例PBC患者和15例健康对照的外周血样本。所有样本均经伦理委员会批准（审批号：Review-PJ-Department-2023-296），且符合EASL 2017诊断标准。转录组测序数据通过FastQC和HISAT2进行质量控制和比对，基因表达量化采用FPKM标准化方法。差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）通过DESeq2筛选（p < 0.05且|log₂FoldChange| > 1）。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）用于识别与PBC相关的关键模块基因，并与MitoCarta 3.0数据库中的1,949个MRGs取交集得到候选基因。通过LASSO回归和支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）算法筛选枢纽基因（Hub Genes），并利用受试者工作特征曲线（ROC）评估其诊断性能（AUC > 0.7）。功能富集分析（GO和KEGG）、基因集富集分析（GSEA）、免疫浸润分析（CIBERSORT）、调控网络构建（miRNA/lncRNA/TF）以及药物预测（DGIdb）进一步阐明基因功能。肝组织免疫组化（IHC）和外周血实时定量PCR（RT-qPCR）验证蛋白和mRNA表达。

结果

1. 差异表达基因鉴定

RNA-seq数据分析显示，30个样本的比对率均高于90%，碱基错误率低于0.1%。共鉴定出1,905个DEGs，其中1,706个上调、199个下调。主成分分析（PCA）和表达分布图表明测序质量高且组间差异显著。

2. 候选基因筛选与功能分析

WGCNA识别出10个共表达模块，其中MEroyalblue模块与PBC相关性最强（|cor| = 0.44, p < 0.05），包含257个基因。与DEGs和MRGs取交集后，得到7个候选基因：AURKA、C1QC、MAOA、RAD51、SHANK2、SPARCL1和TGM2。GO和KEGG富集分析表明这些基因参与组蛋白修饰、突触组织、氧化还原酶活性和酪氨酸代谢等过程。

3. 枢纽基因确定与诊断价值

LASSO和SVM-RFE算法共同筛选出SHANK2和TGM2为枢纽基因。在训练集和验证集（GSE119600）中，SHANK2和TGM2的AUC值均超过0.7（SHANK2 AUC = 0.85; TGM2 AUC = 0.81），表达水平在PBC组显著高于对照组。MAOA因诊断性能较低（AUC = 0.607）被排除。

4. 功能与机制探索

SHANK2与TGM2呈显著正相关（r = 0.42, p < 0.05），且功能相似性评分>0.4。亚细胞定位显示TGM2主要分布于细胞膜，SHANK2位于细胞核和细胞膜。GSEA揭示SHANK2富集于B细胞受体信号通路、T细胞受体信号通路和Wnt信号通路；TGM2则与氧化磷酸化、嘧啶代谢和嘌呤代谢相关。免疫浸润分析显示PBC组中中央记忆CD4⁺ T细胞和M0巨噬细胞浸润增加，而CD8⁺ T细胞和静息NK细胞减少。SHANK2与M0/M1巨噬细胞正相关，TGM2与单核细胞正相关。

5. 调控网络与药物预测

构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，发现SLFN12L、COLCA1和LINC00598通过hsa-miR-665调控SHANK2，而DNAH10OS、SLFN12L等通过hsa-miR-6720-5p调控TGM2。转录因子预测表明TP53调控SHANK2，TFAP2C、REST和PPARG调控TGM2。疾病关联分析（DisGeNET）提示双相情感障碍与两者共同相关。药物预测发现39种靶向TGM2的分子（如顺铂、维生素A）和2种靶向SHANK2的分子（钙、N-甲基-D-天冬氨酸）。

6. 实验验证

免疫组化显示SHANK2和TGM2蛋白在PBC肝组织中显著高表达，且与病理分期相关（SHANK2在I–III期升高，TGM2在所有阶段均升高）。RT-qPCR证实外周血单个核细胞（PBMCs）中SHANK2和TGM2的mRNA水平在PBC患者中显著上调。

讨论

本研究通过多组学方法首次系统性鉴定SHANK2和TGM2为PBC中线粒体相关枢纽基因。两者通过调控免疫代谢通路（如氧化磷酸化、核苷酸代谢）和免疫细胞浸润，桥接线粒体功能障碍与免疫紊乱。其高表达与病理分期正相关，且诊断性能优异，提示作为新型生物标志物的潜力。调控网络分析揭示了非编码RNA和转录因子的复杂调控机制，而药物预测为靶向治疗提供了方向（如维生素A和钙补充剂）。局限性在于样本来源为外周血，未来需通过肝组织单细胞测序进一步验证基因在胆管细胞中的表达。综上，SHANK2和TGM2为理解PBC的分子机制和开发精准疗法提供了重要线索。