纳米材料电荷特性介导Raphidocelis subcapitata脂滴形成的机制研究及其在生物燃料生产中的应用

本研究揭示了功能化碳点（CDs）通过表面电荷依赖性机制调控微藻脂质代谢的新机制。正电荷聚乙烯亚胺功能化碳点（PEI-CDs）通过纳米特异性作用促进脂滴（LDs）形成，而负电荷羧化碳点（CP-CDs）则通过介导氮剥夺（Nitrogen deprivation）效应影响脂质积累。研究采用高内涵成像（HCI）和形态学分析技术，证实电荷属性是决定纳米材料生物效应的关键因素，为藻类生物燃料（Biofuels）的纳米增强策略提供了重要理论依据。

　　

1 Introduction

可再生能源生产对实现全球可持续发展目标至关重要，微藻生物燃料因其高产潜力备受关注。然而如何在维持高生长速率的同时提高中性脂质含量仍是技术瓶颈。前期研究发现聚合物功能化碳点能显著提高Raphidocelis subcapitata的脂质含量，本研究旨在探究其作用机制，重点分析纳米颗粒表面电荷对作用方式的调控作用。

2 Methods

2.1 Starter strain and culture

采用UTEX 1648株系Raphidocelis subcapitata（旧称Selenastrum capricornutum），在24°C、80 μmol s^-1 m^-2光照的OECD培养基中培养，每周以4mL藻液接种400mL新鲜培养基。

2.2 Particle and polymer synthesis

通过柠檬酸-尿素法合成核心碳点，分别用聚乙烯亚胺（PEI10k）功能化获得正电荷PEI-CDs（ζ电位+24.05mV），用琥珀酸酐修饰获得负电荷CP-CDs（ζ电位-18.44mV）。同步合成相应聚合物对照品。

2.4 Experiment setup

通过叶绿素荧光校准细胞浓度至5×10⁴ cells/mL。设置氮剥夺组（10%-50%正常氮浓度）、CDs暴露组（PEI-CDs 0.1-10μg/L，CP-CDs 5-50μg/L）、聚合物对照组及低光照组（10μmol s^-1 m^-2）。

2.6 Chlorophyll-a quantification

采用甲醇-丙酮萃取法测定叶绿素a含量，通过酸处理前后的荧光值变化计算标准化含量（ng/cell）。

2.7 Cell staining and high-content imaging

使用BODIPY 505/515（5μM）染色脂滴，NucBlue染核，通过ImageXpress Micro XLS系统在Cy5（叶绿体自发荧光）、GFP（脂滴）和DAPI（细胞核）通道采集图像。

2.8 Image analysis

采用MetaXpress和CellProfiler 4分析形态学特征，对不同仪器数据实施Z-score标准化，最终筛选152个形态特征中的41个显著变量进行后续分析。

2.9 Statistical analysis

采用随机森林模型（100棵树）对已知处理组（对照、10%氮、CP/PEI聚合物、低光照）训练后预测CDs处理组的机制相似性，模型OOB误差率为8.82%。

3 Results

3.2 Growth inhibition

PEI-CDs 10μg/L（17.07%±8.26%）和PEI聚合物10μg/L（14.95%±5.08%）均引起显著生长抑制（p<0.05），低光照组抑制率达17.67%±2.44%。

3.3 Chlorophyll-a quantification

仅低光照组叶绿素a含量显著升高（1.177×10^-6±1.202×10^-7 ng/cell），PEI-CDs 10μgL组含量（5.413×10^-7±5.325×10^-7 ng/cell）显著低于低光照组。

3.4 Lipid droplet count

PEI-CDs 10μgL组脂滴数量显著增加（4.33±1.82/细胞 vs 对照2.41±1.13），而低光照组显著降低至0.298±0.341/细胞（p<0.05）。CP-CDs组无显著变化。

3.5 Integrated intensity

PEI-CDs 10μgL和PEI聚合物10μgL均引起叶绿体整合荧光强度显著下降（分别降至36654740±8765430和33181564±15410245，对照为48404984±5133519）。

3.6 Morphological characterization

Euclidean距离聚类显示PEI-CDs处理组自成簇群，与PEI聚合物分离；CP-CDs组与低氮处理组聚类，提示机制相似性。

3.7 Random forest categorization

PEI-CDs低剂量组（0.1-1μgL）100%被归类为对照，5μgL组75%为对照；CP-CDs组最高62.5%被归类为10%氮条件，证实其与氮剥夺机制相似。

4 Discussion

正电荷PEI-CDs通过纳米特异性机制促进脂滴形成，该效应与聚合物对照显著不同。其可能机制涉及颗粒内化导致的细胞膜损伤（PEI已知可增加膜通透性），而非 shading效应（低光照实际降低脂含量）。叶绿体荧光强度降低提示光合器损伤，与线粒体中PEI诱导质子链泄漏的报道一致。

负电荷CP-CDs则通过静电吸附培养基中的铵离子（OECD培养基含15mg/L NH₄Cl），间接引发氮剥夺效应。形态学聚类和随机森林分类均支持CP-CDs与低氮处理的相似性，且未表现出纳米特异性。

对于生物燃料应用，PEI-CDs在10μgL超低浓度即可促脂，但存在生长抑制副作用。通过调控表面电荷密度（非核心组成）可能降低毒性——哺乳动物研究中低电荷密度可减少细胞壁相互作用。CP-CDs因无纳米特异性优势，实际应用价值低于直接氮限制策略。

5 Conclusion

本研究首次证实纳米颗粒可通过电荷依赖性机制特异性调控微藻脂代谢。正电荷PEI-CDs通过内化依赖的纳米特异性途径提升脂滴产量，而负电荷CP-CDs通过介导氮剥夺发挥作用。研究为藻类生物燃料的纳米增强策略提供了电荷特性指导原则，未来应重点探索表面电荷密度优化以平衡脂质增产与生长抑制的矛盾。