枯草芽孢杆菌孢子表面展示锰结合结构域提升产量与抗逆性：一种新型疫苗平台的构建与机制研究

本研究创新性地在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）孢子表面展示金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）锰转运蛋白C（MntC）的锰结合结构域，通过分子生物学技术验证其功能性表达。研究证实该改造显著增强孢子锰离子（Mn2+）富集能力，并同步提升孢子产量（48小时达71%）及抗逆性（溶菌酶存活率73%，湿热处理存活率70%），为孢子疫苗平台（如抗原呈递与稳定性增强）提供了突破性策略。

　　

引言

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为一种公认安全的微生物细胞工厂，因其清晰的基因组背景和大规模发酵适用性，被广泛用于重组蛋白生产。在胁迫环境下，该菌可形成代谢休眠且高度抗逆的内生孢子，其多层蛋白外壳结构为异源蛋白表面展示提供了理想平台。孢子展示系统已应用于疫苗递送、酶固定化、生物传感及益生制剂开发等领域。尽管孢子表面展示技术通过重组（如融合CotB、CotC等孢子外壳蛋白）或非重组策略取得进展，但表面展示蛋白对孢子自身生理及发育过程的潜在影响仍未被深入探索。

锰离子（Mn²⁺）是芽孢杆菌孢子形成的关键微量元素，参与氧化应激防御、酶功能调节及孢子外壳组装。早期研究中，锰缺乏会导致孢子发育中断，积累代谢中间物3-磷酸甘油酸（3PGA），并影响孢子特异性基因表达。本研究聚焦金黄色葡萄球菌锰结合脂蛋白MntC的结构域，该域通过长α-螺旋连接两个功能区域，以纳摩尔级高亲和力结合锰，且具备显著免疫原性，已被纳入多个疫苗候选方案。本研究首次探讨其在孢子表面表达对宿主生理特性的调控作用。

材料与方法

通过双交换同源重组策略，将P_cotB-cotB-mntC融合序列整合至枯草芽孢杆菌HT800F（专利号VN103078）的amyE基因位点，构建重组菌株BsHT2380。孢子采用Difco孢子培养基（DSM）诱导产生，并通过溶菌酶处理去除营养体细胞。表面展示通过Western blot、孢子ELISA及共聚焦荧光显微镜验证；锰含量采用火焰原子吸收光谱（F-AAS）测定，并以钙离子（Ca²⁺）为内参标准化；孢子形成率通过Schaeffer-Fulton染色及菌落形成单位（CFU）计数量化；抗逆性测试包括溶菌酶（15 mg/mL，37°C）和湿热（85°C，30分钟）处理。

结果

表面展示MntC的结构验证

Western blot在约70 kDa处检测到CotB-MntC融合蛋白条带，与理论值（66 kDa）一致；孢子ELISA显示BsHT2380信号显著高于对照（p ≤ 0.0001）；共聚焦显微镜下BsHT2380孢子呈现明显绿色荧光，证实MntC定位于孢子外壳。

锰离子富集与EDTA敏感性

BsHT2380孢子锰钙比（Mn/Ca）在48小时时较对照提高1.23倍，EDTA处理导致其锰含量下降45.64%（对照仅25.66%），表明MntC介导了表面锰的特异性结合与可逆解离。

孢子形成动力学增强

Schaeffer-Fulton染色显示BsHT2380在48小时成熟孢子数量显著多于对照。CFU计数表明，其孢子形成率在32小时达63%（对照<50%），48小时达71%（对照约55%），72小时维持74%高位，证实MntC表达加速孢子发育进程。

抗逆性能提升

BsHT2380孢子经溶菌酶处理后存活率达73%（对照50–57%），湿热处理后存活率为70%（对照55–59%），差异均具统计学显著性（p < 0.05–0.0001），表明表面锰富集与CotB-MntC融合共同增强了孢子结构稳定性。

讨论

本研究成功构建了表面展示MntC锰结合结构域的重组枯草芽孢杆菌孢子，并发现其通过增强锰离子捕获能力，间接促进孢子形成效率与抗逆性。机制上，表面结合的锰可能为孢子外壳组装相关酶（如锰超氧化物歧化酶SodA）提供局部高浓度辅因子，优化外壳结构；同时，高亲和力锰结合与可控释放可能改善群体孢子发育微环境。

该策略为孢子疫苗平台开发提供了双优势：一方面，MntC作为金黄色葡萄球菌的高免疫原性抗原，可直接用于黏膜疫苗设计；另一方面，孢子产量与稳定性提升降低了生产成本与存储要求。未来研究可聚焦多价抗原共展示与体内免疫效价评估，进一步拓展孢子平台在生物医学中的应用边界。