下丘脑室旁核催产素能神经元介导HT7电针改善心肌缺血的关键机制与神经心脏轴验证

本研究发现电针（EA）神门穴（HT7）通过抑制下丘脑室旁核（PVN）中催产素能（OT）神经元活性，显著改善急性心肌缺血（AMI）后的心功能，并减少心肌纤维化。结合化学遗传学技术，研究证实PVNOT神经元是电针心脏保护效应的必要且充分条件，揭示了一条从HT7到PVN再到心脏的神经调控通路（HT7–PVNOT–heart轴），为针灸治疗缺血性心脏病提供了机制依据和创新靶点。

　　

引言

心肌缺血（MI）是冠状动脉疾病的重要表现，尽管药物和介入治疗不断进步，它仍是全球发病和死亡的主要原因。其病理生理过程包括氧化应激、线粒体功能障碍和炎症激活，导致不可逆的心肌细胞凋亡，因此迫切需要新的心脏保护策略。近年研究表明，下丘脑室旁核（PVN）中的催产素能（OT）神经元在心肌梗死模型中显著激活，提示其在疾病发生中具有潜在作用，但具体机制尚不明确。此外，研究显示在缺氧等多种应激状态下，下丘脑催产素（OT）水平在多个心血管核团和外周组织中升高。

电针作为一种源于中医并日益融入现代临床实践的治疗方法，显示出良好的心血管效应。神门（HT7）是心经上的一个经典穴位，广泛用于治疗心脏疾病。临床前研究表明，电针HT7可调节自主神经功能并减少缺血性心律失常，然而其确切的神经生物学机制，尤其是PVN^OT信号通路的参与，仍 largely 未被探索。

本研究验证了如下假设：电针HT7通过调控PVN中的OT神经元来减轻心肌缺血损伤，从而激活心脏保护通路。通过整合化学遗传学、病毒神经元追踪和分子分析技术，我们量化了AMI期间电针诱导的PVN^OT神经元激活，并评估了它们在介导心脏保护中的必要性和充分性。研究结果确立了一个新的HT7–PVN^OT–心脏轴，为针灸作为缺血性心脏病的辅助疗法提供了机制证据。

材料与方法

动物

C57BL/6?J小鼠购自杭州子源实验动物技术有限公司。所有动物在无特定病原体（SPF）条件下饲养，环境温度控制在22±1°C，光暗周期12小时。自由摄取食物和水。适应1周后开始实验程序。

建立了四个独立队列：队列I（n=18）：假手术组（n=6）、AMI组（n=6）、AMI+EA-HT7组（n=6）。队列II（n=18）：假手术组（n=6）、AMI组（n=6）、AMI+EA-HT7组（n=6）。队列III（n=18）：OT激活组（n=6）、OT抑制组（n=6）、OT对照组（n=6）。队列IV（n=24）：AMI+OT对照组（n=6）、AMI+EA-HT7+OT对照组（n=6）、AMI+OT抑制组（n=6）、AMI+EA-HT7+OT激活组（n=6）。

所有程序均经安徽中医药大学动物伦理委员会批准。

急性心肌梗死模型

小鼠在诱导室中用3%异氟烷麻醉，随后用1–1.5%异氟烷维持。剃毛并消毒胸部区域后，于第四肋间进行左开胸术以暴露心脏。用6-0缝线在观察到心肌变白的部位结扎左前降支（LAD）冠状动脉。结扎后关闭胸腔，排出残留空气，并注射青霉素预防感染。成功的AMI通过心电图ST段抬高>0.1?mV确认。假手术组只穿线不结扎。

电针干预

AMI诱导后立即在安静环境中进行电针干预。针灸针垂直插入（深度：1?mm）双侧神门（HT7），位于腕横纹尺侧。连续波刺激（2?Hz，1?mA）每天30分钟，连续3天。假手术组和AMI组不接受电针。

动物麻醉与安乐死

所有实验遵循最小化动物痛苦的原则。在模型建立、电针干预、电生理测试和立体定位脑注射过程中，使用异氟烷气体麻醉。动物首先放入诱导室，用3%异氟烷麻醉。一旦不动，转移到麻醉面罩，浓度调整为1–1.5%以维持麻醉。安乐死采用5%异氟烷吸入超过1分钟。心跳和呼吸消失确认死亡。尸体运至安徽中医药大学实验动物中心指定回收设施。

HE染色

苏木精-伊红（HE）染色用于评估心肌组织的病理变化。样品在4%多聚甲醛中4°C固定24小时，随后脱水、包埋、切片、脱蜡、苏木精和伊红染色。封片后在明场显微镜下进行形态学评估。

Masson染色

组织收集后在4%中性甲醛中固定24–48小时，石蜡包埋制备4–5?μm切片，60°C烘烤2小时。切片在二甲苯I和II中各10分钟脱蜡，无水乙醇5分钟脱水，依次浸入梯度乙醇（95%、80%、70%，各2分钟），蒸馏水冲洗。核染色采用Weigert铁苏木精5–10分钟，冲洗10分钟，1%盐酸乙醇分化，碳酸锂返蓝。胞质染色用丽春酸品红5分钟，随后1%磷钼酸分化3分钟。胶原纤维用苯胺蓝或亮绿染色5分钟，1%醋酸短暂冲洗，95%乙醇和无水乙醇I/II各2分钟脱水，二甲苯5分钟透明，中性树脂封片。

免疫荧光染色

冰冻切片用PBS洗三次每次5分钟，0.5% Triton X-100室温透化30分钟。用5%山羊血清室温封闭2小时。一抗用封闭液稀释（1:500）覆盖组织，切片4°C避光湿盒中过夜孵育。洗三次每次10分钟后，荧光标记二抗（1:500）室温避光孵育2小时。洗片，DAPI复染5–10分钟，抗荧光淬灭剂封片，指甲油封边。使用PanoBrain玻片扫描仪成像。

心电图

使用PowerLab系统记录心电图以监测心功能。电极皮下植入右前肢和左后肢，右后肢肌肉内植入。一旦获得稳定波形，继续记录以评估心率（HR）和心率变异性（LF/HF比值）。

超声心动图

通过超声心动图评估左心室功能。测量参数包括射血分数（EF%）、缩短分数（FS%）、左心室舒张末期内径（LVIDd, mm）、左心室收缩末期内径（LVIDs, mm）、左心室舒张末期容积（LVEDV, mL）和左心室收缩末期容积（LVESV, mL）。

电生理学

麻醉后，小鼠俯卧，头固定在立体定位仪上。剃头皮，碘伏消毒，中线切口。分离结缔组织暴露颅骨表面。利用缝际标志识别前囟和后囟，调整头部使偏差在0.02?mm内。在PVN靶点上方钻颅骨孔（直径0.3?mm）。微电极推进至PVN，电极用牙科水泥固定。

微量注射

异氟烷麻醉（诱导3%，维持1%）后，小鼠固定在立体定位仪上。耳棒对称放置，确保颅骨水平。通过鼻对齐、无头部运动、颅骨水平放置确认固定良好。剃毛消毒头皮后，中线切口，去除硬脑膜暴露Bregma。相对于Bregma的坐标为：AP –1.07?mm, ML ±0.24?mm, DV –4.8?mm。在PVN上方钻小孔，使用RWD微量注射器以0.15?μL/min速度注射20?nL病毒载体。留针5–10分钟防止返流。

统计分析

数据分析和图表生成使用GraphPad Prism 8.0。数据表示为均值±标准差。正态性检验采用Shapiro–Wilk检验。方差齐性采用Brown-Forsythe检验。两组比较数据先进行正态性检验。符合正态性的采用Student’s T检验或Paired T检验分析。不符合正态性的进行Mann–Whitney检验或Wilcoxon检验。对多组比较的实验数据进行正态性和方差齐性检验。如果均满足，采用单因素方差分析；如果不满足，进行Kruskal-Wallis H秩和检验，随后组间分析采用Dunn多重比较。相关性使用Pearson相关系数评估。p < 0.05认为有统计学意义。

结果

电针HT7对心肌损伤和心功能的影响

通过检查不同干预对心肌损伤和心功能的影响，观察到与假手术组相比，AMI组HE染色显示明显心肌结构破坏、纤维紊乱和炎症细胞浸润。Masson染色显示胶原纤维沉积（蓝色）增加，表明AMI存在心肌损伤和纤维化。超声心动图显示射血分数（EF）和缩短分数（FS）显著降低（p < 0.05），左心室舒张末期内径（LVIDD）、左心室收缩末期内径（LVIDS）、左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）显著增加（p < 0.05）。与AMI组相比，HT7电针治疗导致心肌组织结构恢复、炎症细胞浸润减少、胶原沉积减轻，EF和FS显著增加（p < 0.05），LVIDD、LVIDS和LVESV显著降低（p < 0.05）。这些发现表明HT7刺激 alleviated AMI诱导的心肌损伤和左心室功能障碍。

电针HT7对PVN脑电活动的影响

通过检查不同干预对下丘脑室旁核（PVN）神经元放电的影响，发现与假手术组相比，AMI组峰值放电数量显著增加（p < 0.05），表明AMI期间PVN被激活。相比之下，HT7治疗后峰值放电数量显著减少（p < 0.05），表明电针HT7抑制了下丘脑PVN的神经元活动。

电针介导的心功能改善与脑电活动密切相关

对HT7干预期间心功能指标与PVN峰值放电进行相关性分析。结果表明，心功能变化与PVN神经元放电显著相关（p < 0.05）。

电针HT7对PVN催产素能神经元的变化

使用腺相关病毒（AAV）标记OT神经元，随后进行c-fos免疫荧光检测。发现OT神经元与c-fos共定位，表明PVN中的催产素能神经元在心肌缺血期间被激活。此外，AMI组激活的OT神经元表达显著增加（p < 0.05）。相比之下，HT7干预后，激活的OT神经元数量显著减少（p < 0.05）。这些结果表明PVN中的催产素能神经元可能参与了电针缓解心肌缺血的机制。

通过调控PVN催产素能神经元改变PVN脑电波

进行化学遗传学调控OT神经元以评估其在PVN活动中的作用。在正常生理条件下，激活OT神经元显著增加PVN的神经元放电水平（p < 0.05），而抑制OT神经元显著降低PVN神经元放电（p < 0.05）。在AMI病理模型中，激活OT神经元也升高了PVN的神经元放电水平（p < 0.05），而抑制OT神经元显著降低PVN神经元放电（p < 0.05）。

通过调控PVN催产素能神经元改变心功能

在正常生理条件下，激活OT神经元显著增加心率（HR）和心率变异性（p < 0.05），而抑制OT神经元显著降低HR和心率变异性（p < 0.05）。此外，激活OT神经元增强左心室功能（p < 0.05），而抑制OT神经元降低左心室功能（p < 0.05）。这些发现表明PVN中的OT神经元可能在心功能调节中起作用。

激活PVN催产素能神经元可逆转电针HT7的有益效应

化学遗传学抑制OT神经元产生与电针相当的治疗效果，改善心肌损伤、减少胶原沉积并增强心功能。然而，激活OT神经元逆转了电针的这些有益效应，表明PVN中的催产素能神经元可能是介导电针在AMI中心脏保护作用的关键靶点。

PVN催产素能神经元的下游投射核团作为未来潜在研究目标

从注射AAV-OT-mCherry病毒的PVN区域获取的脑和脊髓切片显示 several 下游纤维投射位点，包括中脑导水管周围灰质（PAG）。值得注意的是，在胸髓观察到病毒轴突表达，这是心脏输出中枢调节的关键中心。为确认此通路的存在，进行了病毒追踪实验。将逆行AAV-cre-OT病毒注射到T1胸髓，同时将AAV-hSyn-DIO-mCherry病毒注射到PVN，确认了连接PVN OT神经元到脊髓的单突触通路。

讨论

本研究提供了 compelling 证据，证明下丘脑室旁核（PVN）催产素能（OT）神经元在介导电针（EA）神门穴（HT7）对小鼠急性心肌缺血（AMI）模型的心脏保护效应中扮演神经调节角色。

我们的结果表明，电针HT7显著改善心功能，表现为射血分数（EF）增加和左心室尺寸及容积减少，这与心肌组织学结构改善相关。这些发现清楚地表明针灸能有效缓解缺血引起的心肌损伤。与此一致，由梁凤荣教授团队进行的一项随机临床试验发表在JAMA Internal Medicine上，证实针灸作为抗缺血药物的辅助疗法，在404名患者中显著降低了心绞痛的频率和严重程度，且安全性良好。这一临床证据为本研究提供了宝贵的转化见解。

PVN作为自主神经和内分泌调节的中枢枢纽，通过多种途径调节心功能。它整合来自前脑区域如前额叶皮层和杏仁核的输入，并投射纤维到脑干的心血管中心，包括 rostral ventrolateral medulla、孤束核和迷走神经背核。此外，PVN直接影响节前交感神经元，从而调节心率和心肌收缩力。在本研究中，抑制PVN中的OT神经元降低了心率变异性（LF/HF），表明其在自主神经平衡中起作用。先前研究 similarly 报道OT神经元能增强交感活性。脊髓心血管中心的OT神经元已被证明能升高血压和心率。此外，向星状神经节或颈中神经节注射催产素增加了心率和心肌收缩力，表明参与了心脏调节的胸交感神经节被激活。在本研究中，这些心脏保护效应与PVN神经元放电减少和PVN^OT神经元的特异性抑制相关。总的来说，这些发现建立了电针诱导的神经调节与心脏改善之间的功能联系。化学遗传学实验进一步证实了一个因果性神经心脏轴，其中PVN^OT神经元是电针HT7减轻心肌缺血必要且充分的。

PVN作为神经和激素信号的关键整合器以维持心血管稳态。我们的发现突出了PVN^OT神经元在此过程中的关键作用。在生理条件下，化学遗传学调控PVN^OT神经元改变了PVN电活动和心功能，证实了它们参与基线心血管调节。在AMI期间，激活PVN^OT神经元消除了电针的心脏保护效应，强调了它们作为治疗靶点的重要性。这些结果提供了对电针益处的神经生物学机制的见解，并表明调控PVN^OT神经元可能代表一种有前景的缺血性心脏病治疗策略。

对PVN^OT神经元下游投射的研究揭示了其效应的额外机制。在中脑导水管周围灰质（PAG）中识别出纤维投射，PAG参与疼痛和心血管调节。更值得注意的是，从PVN OT神经元追踪病毒轴突至胸髓，这是心脏输出调节的关键中心。这些观察与先前发现一致，表明PVN^OT脊髓投射神经元直接影响心功能，并可能在AMI后驱动交感神经过度激活。PVN^OT神经元到脊髓的单突触通路的证明进一步支持了这一机制，并加强了与电针介导的心脏保护的联系。

这些发现的临床意义重大。针灸作为缺血性心脏病的辅助疗法，可能提供一种非药物方法来改善心功能并降低不良心血管结局的风险。通过靶向PVN^OT神经元，针灸可以激活心脏保护通路并促进心肌修复。需要进一步的转化研究来探索这些机制并评估它们对患者护理的潜力。

尽管本研究有优势，但应承认几个局限性。包括相对较小的样本量（n=6）、仅使用雄性小鼠以及AAV病毒载体的潜在非特异性效应。此外，这项工作是在小鼠AMI模型中进行的，其直接适用于人类仍不确定。尽管识别了PVN^OT神经元的下游投射，但其心脏保护效应的精确分子机制需要进一步阐明。未来研究应旨在阐明所涉及的信号通路，并评估靶向PVN^OT神经元在缺血性心脏病临床人群中的治疗潜力。

总之，本研究确立了一个新的神经心脏轴（HT7–PVN^OT–心脏），并提供了对电针HT7心脏保护效应的机制见解。通过靶向PVN^OT神经元，针灸成为一种有前景的缺血性心脏病治疗方法。需要进一步研究以推进这些发现的转化潜力，并为患有此病的患者开发靶向神经心脏干预措施。