探索希腊放线菌生物多样性：发掘具有皮肤抗衰老潜力的新型生物活性代谢物

本文系统筛选了来自希腊生态系统的980株放线菌，通过体外酶抑制实验、细胞毒性及功效评估，发现多株菌株具有显著酪氨酸酶及弹性蛋白酶抑制活性。经培养优化及分离纯化，最终获得六种生物活性分子（包括环二肽及黄酮类化合物），并在细胞模型及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中验证其抗氧化、自噬-溶酶体（autophagy-lysosome）及泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）调控作用。研究表明希腊放线菌资源在开发抗皮肤衰老新型活性成分方面具有重要潜力。

　　

引言

放线菌（Actinobacteria）是一类革兰氏阳性、高G-C含量的细菌，属于放线菌门（Actinomycetota）。该类群分布广泛，是已知生物活性微生物代谢物的重要来源，近半数已知活性化合物源于此。链霉菌属（Streptomyces）作为其中最具代表性的属，具有极高的次级代谢潜力，平均每株可产生超过30种活性分子。希腊因其特殊地理与气候条件，孕育了丰富的放线菌资源，为药物开发提供了独特来源。

皮肤衰老是内源性与外源性因素共同作用的结果，主要表现为皱纹形成、弹性丧失及色素沉着等。外源性老化中，光老化（photoaging）贡献超过80%的面部皮肤老化。其分子机制涉及弹性蛋白降解、酪氨酸酶活性上调、活性氧（ROS）积累以及蛋白质稳态（proteostasis）失衡。因此，针对弹性蛋白酶（elastase）、酪氨酸酶（tyrosinase）、抗氧化通路及自噬-蛋白酶体系统的调控成为抗衰老研究的关键靶点。

材料与方法

本研究自希腊多种生态系统（土壤、根际、叶片及海洋沉积物）分离得到980株放线菌，经形态学与16S rRNA测序鉴定，涵盖链霉菌属、拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）、诺卡氏菌属（Nocardia）等。通过优化培养条件，选择ISP4培养基进行大规模发酵，采用丙酮-乙酸乙酯分级提取法制备1960个粗提物。

活性筛选分为两部分：首先通过体外酶学实验评价提取物对酪氨酸酶和弹性蛋白酶的抑制率，筛选标准为抑制率分别超过25%和20%；进而利用BJ人成纤维细胞、B16-F10黑色素瘤细胞和HaCaT人永生化角质形成细胞评估活性提取物的细胞毒性及细胞内酶抑制活性。最终通过活性追踪导向分离，结合高效液相色谱（HPLC）、制备薄层色谱（TLC）及核磁共振（NMR）等技术鉴定纯化合物结构。

结果

提取物筛选与活性评价

在1960个提取物中，337个表现出酶抑制活性，其中316个具酪氨酸酶抑制活性，15个具弹性蛋白酶抑制活性，6个同时抑制两种酶。乙酸乙酯提取物活性显著高于甲醇提取物。进一步细胞毒性实验发现，29个提取物在BJ和HaCaT细胞中无明显毒性（细胞存活率 >90%）。细胞水平验证发现，三株链霉菌（ATHUBA 292、336、1011）和一株拟无枝酸菌（ATHUBA 1011）提取物具有持续酶抑制活性。

活性成分分离与结构鉴定

选择活性最显著的Streptomyces sp. ATHUBA 292进行放大培养与化合物分离，最终获得六种纯化合物：Cyclo(L-proline-L-tyrosine) (1)、Cyclo(Pro-Phe) (2)、Lumichrome (3)、p-(acetylamino)benzoic acid (4)、Daidzein (5)、Uracil (6)。其结构经高分辨质谱（HRESIMS）及一维/二维NMR验证。

纯化合物生物活性

在细胞模型中，化合物1和4在2 μM浓度下分别表现出26%和23%的弹性蛋白酶抑制率，但无一化合物显示显著酪氨酸酶抑制活性。抗氧化实验表明，化合物3、5、6可降低HaCaT细胞中的ROS水平；化合物2、3、6在BJ细胞中也显示ROS清除能力。

在蛋白酶体与溶酶体活性方面，所有化合物均未激活26S蛋白酶体的β5亚基（chymotrypsin-like活性），但除化合物1外，其余均显著提升溶酶体cathepsin活性，提示其可能通过自噬-溶酶体途径增强蛋白质降解。

黑腹果蝇体内实验

选择化合物1、2、4、6进行果体内评价。结果显示，化合物1和2可显著提升蛋白酶体β5亚基活性及溶酶体cathepsin活性；化合物4和6则抑制蛋白酶体活性但激活抗氧化反应。通过转基因果蝇模型（GstD1-ARE:GFP）证实，所有化合物均能诱导CncC（Nrf2果蝇同源物）转录活性，触发抗氧化反应。其中化合物2诱导效果最强，呈剂量依赖性。

讨论

本研究从希腊放线菌资源中成功分离出多种具有抗皮肤衰老潜力的活性分子，其作用机制不仅限于酶抑制，还涉及抗氧化、蛋白酶体激活及自噬-溶酶体通路调控。其中环二肽类化合物（如Cyclo(L-Pro-L-Tyr)）与苯甲酸衍生物（如p-(acetylamino)benzoic acid）表现出较好的弹性蛋白酶抑制活性与低细胞毒性，而Daidzein和Uracil则主要通过抗氧化和溶酶体激活发挥功能。

值得注意的是，尽管粗提物显示显著酪氨酸酶抑制率，纯化合物却未能在细胞模型中重复该效果，提示粗提物中的活性可能源于多种成分的协同效应。此外，本研究首次报道Lumichrome和Uracil在调节溶酶体功能及抗氧化反应方面的潜力。

结论

希腊放线菌生物多样性是发现新型抗皮肤衰老活性分子的宝贵资源。本研究筛选出的六种化合物通过多靶点、多通路机制发挥抗衰老作用，包括酶抑制、氧化应激缓解和蛋白质稳态调控。这些分子具备开发为化妆品活性成分或抗衰老膳食补充剂的潜力，未来研究可进一步探索其制剂稳定性、透皮性能及临床适用性。