wbtF基因作为土拉弗朗西斯菌新型亚种感染中的细胞毒性相关因子及其在胞内复制与细胞器逃逸中的作用机制研究

本研究通过构建土拉弗朗西斯菌新型亚种（Francisella novicida）转座子突变体文库，结合表达FcγRII的HeLa细胞（HeLa-FcγRII）新型感染模型，筛选出13个细胞毒性减弱的突变株。研究发现wbtF基因缺失突变体在HeLa-FcγRII和THP-1细胞中胞内复制能力显著下降，且无法有效逃逸吞噬溶酶体（phagolysosome）、线粒体（mitochondria）和高尔基体（Golgi complex）的捕获。该基因作为O抗原合成簇关键成员，不影响细胞因子（TNF-α、IL-6）应答，但直接调控细菌的胞内生存与致病机制。

　　

背景

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是一种高致病性革兰阴性菌，可引发人畜共患的土拉热（tularemia）。其近缘种Francisella novicida（F. novicida）毒力较低，但基因组高度同源，常被用作研究F. tularensis感染的模型菌株。本研究旨在通过构建F. novicida转座子突变体文库，筛选与细胞毒性相关的致病因子。

方法

研究团队利用表达小鼠FcγRII的HeLa细胞（HeLa-FcγRII细胞）建立新型感染模型，筛选了2,232个经抗血清预处理的F. novicida转座子突变体。通过测序鉴定插入位点，并采用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞毒性。利用绿色荧光蛋白（GFP）标记菌株，通过共聚焦显微镜观察细菌在细胞内的定位与复制动态，同时采用LysoTracker、MitoTracker、BODIPY TR ceramide等荧光探针标记细胞器，分析细菌与溶酶体、线粒体、高尔基体的共定位情况。

结果与发现

1. 1.
   突变体筛选与基因鉴定
   共鉴定出13个细胞毒性减弱的突变株，涉及figE、slt、fopA、iglC、iglD、iglF、iglI、pdpB、pdpA、ampG、wbtF以及一个未命名基因（FTN_0096）。其中wbtF基因功能未知，被选为深入研究对象。
2. 2.
   wbtF缺失导致胞内复制缺陷
   野生型（WT）F. novicida在HeLa-FcγRII和THP-1细胞中能高效复制，而wbtF突变体在感染12小时后菌量显著下降。回补实验证实wbtF功能恢复可挽救复制缺陷。
3. 3.
   吞噬溶酶体逃逸失败
   wbtF突变体在感染早期（2–6小时）与溶酶体标记物LysoTracker和LAMP-1高度共定位（60%–88%），而WT菌株极少共定位，表明wbtF缺失导致细菌无法逃逸吞噬溶酶体，进而被降解。
4. 4.
   线粒体与高尔基体滞留
   wbtF突变体在感染过程中与线粒体（MitoTracker标记）和高尔基体（BODIPY TR ceramide标记）显著共定位（61%–78%），而WT菌株几乎不滞留于这些细胞器。提示wbtF可能参与调控细菌与细胞器的互作，避免被宿主防御机制捕获。
5. 5.
   细胞因子应答无显著影响
   wbtF突变体感染THP-1细胞后，肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的分泌水平与WT菌株无显著差异，表明其毒力减弱并非由免疫应答激活导致。

讨论

wbtF基因位于F. novicida的O抗原合成基因簇中，已知O抗原是弗朗西斯菌的关键毒力因子，但具体机制尚未明确。本研究首次揭示wbtF在细菌胞内生存中的多重作用：

• •
  促进吞噬溶酶体逃逸，避免被降解；
• •
  调控与线粒体和高尔基体的互作，可能通过干扰线粒体自噬（mitophagy）或免疫信号转导（如STING-TBK1通路）增强生存；
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  不影响LPS介导的炎症应答，提示其功能独立于经典免疫激活途径。
  这些发现为针对弗朗西斯菌感染的靶向治疗提供了新思路，wbtF可能成为潜在的抗感染靶点。

结论

wbtF是F. novicida的关键毒力因子，通过调控细菌在宿主细胞内的定位与复制，影响其逃逸吞噬溶酶体、线粒体和高尔基体的能力。该研究不仅深化了对弗朗西斯菌致病机制的理解，也为开发新型抗感染策略提供了理论依据。