莱茵衣藻叶绿体高效表达猪圆环病毒2型Cap抗原及其免疫原性研究

本研究成功利用莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）叶绿体表达平台，通过基因枪轰击法将密码子优化的PCV2 ORF2基因导入叶绿体基因组，经多轮抗性筛选获得转化藻株。PCR、RT-PCR证实外源基因的整合与转录，Western blot和ELISA验证28 kDa Cap蛋白的表达及其抗原性，为低成本生产重组疫苗蛋白提供了新策略。

　　

1 引言

猪圆环病毒2型（PCV2）作为圆环病毒科（Circoviridae）成员，是断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原体，不仅与猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎等疾病相关，更易与其他病原体共感染，给全球养猪业造成巨大经济损失。由于管理策略和共感染控制措施在降低猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）发病率方面效果有限，疫苗接种仍是预防PCV2感染的最有效手段。由ORF2基因编码的免疫原性衣壳（Cap）蛋白因其多重抗原表位，成为商业化疫苗的靶标抗原。

目前重组Cap蛋白已在大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统、酵母表达系统以及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中成功表达，其中杆状病毒/昆虫细胞表达的蛋白已进入市场化阶段。然而高昂的生产成本仍是限制Cap抗原蛋白应用扩大的主要瓶颈。

近年来，植物叶绿体中表达药用蛋白已成为植物生物技术研究热点。与细胞核表达系统相比，叶绿体表达系统具有独特优势：不存在基因沉默现象和抑制重组蛋白表达的机制；外源基因不会随花粉传播而逃逸，有助于提高生物安全性。莱茵衣藻被称为"绿色酵母"，是叶绿体遗传转化研究中的低等模式植物，其生长周期短、培养简单，可大幅降低生产成本。此外，莱茵衣藻拥有单个大型叶绿体，内含多种分子伴侣和折叠酶（二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等），为重组蛋白的正确折叠和组装提供了一定保障。

2 材料与方法

2.1 藻株与材料

实验采用野生型莱茵衣藻菌株CC-137，在Tris-乙酸-磷酸酯（TAP）液体培养基中于160 rpm、25°C、12 h/12 h光周期条件下培养。质粒patpX（约3.95 kb）和p64D（约9.8 kb）由实验室保存。patpX包含一组多克隆位点，携带atpA基因的5′启动子（包括5′-UTR）和rbcL基因的3′终止子。质粒p64D包含aadA抗性基因盒和同源重组片段（clpP–trnL–petB–chlL–rpl23–rpl2）。

2.2 ORF2基因优化与合成

为提高PCV2主要抗原基因ORF2（GenBank: AY035820.1）的表达效率，根据莱茵衣藻叶绿体基因组的密码子偏好性对ORF2基因序列进行优化合成，并在密码子优化的ORF2序列5′和3′端分别添加NcoI和XbaI限制性酶切位点。

2.3 莱茵衣藻叶绿体表达载体构建

将质粒patpX和优化的ORF2基因用NcoI和XbaI双酶切，将ORF2基因与patpX的大片段连接。ORF2编码区位于叶绿体特异性启动子PatpA、atpA的5′-UTR和rbcL终止子之间。从叶绿体表达中间载体pAF25中获得ORF2基因表达盒，用EcoRV和NotI酶切pAF25，将较小片段（约1.8 kb）用Klenow大片段酶补平后亚克隆到经EcoRV酶切的p64D质粒中，成功构建ORF2基因的特异性莱茵衣藻叶绿体表达载体pCR02。

2.4 莱茵衣藻叶绿体转化与抗性筛选

采用PDS100/He基因枪系统将包裹有pCR02质粒的金粉轰入野生型莱茵衣藻。暗培养12小时后，将轰击后的莱茵衣藻细胞用TAP液体培养基洗涤并涂布于含有100 μg/mL壮观霉素的TAP固体培养基上。在12 h/12 h光周期、25°C条件下培养10-14天，无抗性的莱茵衣藻细胞逐渐白化死亡，抗性细胞在固体选择培养基上长成单绿色菌落。

2.5 抗性藻细胞PCR检测

采用CTAB法提取抗性藻细胞和野生型菌株的总DNA。使用特异性引物P1和P2检测抗性藻细胞中的ORF2基因，以pCR02质粒为阳性对照，野生型莱茵衣藻为阴性对照。此外，使用引物P3和P4（分别互补于ORF2基因和莱茵衣藻叶绿体基因组的chlL基因）检测ORF2基因盒在莱茵衣藻叶绿体基因组中的整合位点。

2.6 转基因藻细胞RT-PCR分析

使用总RNA提取试剂盒制备转基因藻细胞和野生型莱茵衣藻的总RNA，以检测ORF2基因的转录水平。使用PrimeScript? RT试剂盒与gDNA Eraser合成各品系的cDNA，在ORF2特异性引物P1和P2下进行RT-PCR检测。

2.7 SDS–PAGE和Western blotting分析

按照先前描述的方法提取莱茵衣藻转化子和野生型菌株的粗蛋白。收集对数生长期的液体藻细胞15 mL，离心后沉淀重悬于200 μL蛋白裂解液（750 mM Tris–HCl, pH 8.0, 15%蔗糖, 100 mM β-巯基乙醇和1 mM PMSF）中，4°C、12,000 r/min离心20分钟。上清为总可溶性蛋白（TSP），用于Cap蛋白分析。使用Bradford蛋白测定法测定蛋白浓度。

蛋白样品通过12% SDS–PAGE分离并直接转移到PVDF膜上。膜在5%脱脂奶粉中饱和2小时，用TBST洗涤后，依次与兔抗PCV2 Cap多克隆抗体（1:10,000）4°C过夜孵育，然后与1:5,000稀释的羊抗兔IgG抗体室温孵育1-2小时。通过添加ECL化学发光显色溶液显示目标蛋白。

2.8 ELISA分析

使用ELISA测定莱茵衣藻转化子粗提物中Cap蛋白的抗原性。将粗蛋白样品加入已包被PCV2 Cap抗体的96孔微孔板中，37°C反应30分钟，PBST洗涤后与HRP–PCV2 Cap抗体37°C处理30分钟。然后加入显色液37°C孵育15分钟，终止显色反应后监测A450处的吸光度。

3 结果

3.1 莱茵衣藻叶绿体表达载体构建

ORF2基因序列根据莱茵衣藻叶绿体基因表达偏好性进行优化。用EcoRV和NotI从pAF25中切下ORF2基因表达盒片段，用Klenow大片段酶补平后插入载体p64D的EcoRV位点，构建莱茵衣藻叶绿体表达载体pCR02。该载体包含优化的ORF2抗原基因盒、aadA抗性基因盒和同源片段（clpP–trnL–petB–chlL–rpl23–rpl2），ORF2抗原基因两侧为莱茵衣藻叶绿体特异性调控元件PatpA和TrbcL。

3.2 抗性藻细胞的获得

用包裹有pCR02质粒的金粉轰击野生型莱茵衣藻细胞后，在含有100 μg/mL壮观霉素的TAP固体培养基上培养10-14天，出现13个抗性绿色藻落，而大多数藻细胞白化死亡，表明ORF2基因和aadA抗性基因可能已导入莱茵衣藻叶绿体，且抗性基因已表达。

3.3 抗性藻细胞PCR分析

提取野生型和抗性藻细胞的总DNA，使用ORF2基因的特异性引物P1和P2进行检测。在四个抗性藻细胞和阳性对照中检测到预期的ORF2片段（0.75 kb PCR产物），而在野生型藻株中未检测到，表明ORF2基因可能已整合到莱茵衣藻叶绿体基因组中。

为验证ORF2基因是否正确整合到叶绿体基因组的特定位点，使用引物P3和P4（分别互补于叶绿体chlL基因和ORF2基因）检测插入位点。在藻转化子和阳性对照中预期获得约1.4 kb产物，而在野生型中未出现相应大小的产物。经过七轮壮观霉素抗性筛选的藻转化子中获得1.4 kb片段，野生型藻细胞中未出现，表明外源ORF2基因已位点特异性整合到莱茵衣藻叶绿体基因组中。

3.4 转基因莱茵衣藻中ORF2基因转录水平测定

使用ORF2特异性引物P1和P2对cDNA进行RT-PCR，测定ORF2基因的转录水平。转基因藻转化子中显示单一的0.5 kb条带，表明转录状态正常，而野生型藻细胞中未扩增出条带。此外，直接使用总RNA进行PCR扩增以去除可能被DNA污染的样品，结果表明在相同体系和条件下未发现条带，验证了RT-PCR的特异性。

3.5 Western blotting分析

提取转化子和野生型莱茵衣藻的总可溶性蛋白，通过SDS–PAGE和Western blotting分析验证Cap蛋白的表达。使用兔抗PCV2 Cap多克隆抗体和羊抗兔IgG抗体进行杂交。在四个莱茵衣藻转化子中检测到28 kDa蛋白，而在野生型菌株中未检测到蛋白，表明Cap蛋白已在莱茵衣藻叶绿体中积累。

3.6 ELISA分析

使用ELISA检测莱茵衣藻叶绿体中表达的Cap蛋白的抗原性。从野生型和转基因莱茵衣藻中提取的总可溶性蛋白样品与PCV2 Cap抗体和HRP标记的PCV2 Cap抗体反应，监测OD450处的吸光度。结果表明在四个莱茵衣藻转化子中观察到显著的颜色反应，且均检测到吸光度值，表明在莱茵衣藻叶绿体中表达的Cap蛋白具有抗原性。

4 讨论

尽管昆虫/杆状病毒系统表达的Cap抗原疫苗可用，但由于生产成本低、产品可实现口服输送无需纯化、以及真核和原核蛋白均可在莱茵衣藻叶绿体中表达等优势，在莱茵衣藻中生产基因工程疫苗近年来受到广泛关注。本研究将优化的ORF2基因重组并在莱茵衣藻叶绿体中表达，结果表明Cap蛋白已成功表达并具有抗原性，证明莱茵衣藻叶绿体是重要重组蛋白的可行表达平台。

目前，在衣藻叶绿体中表达的外源蛋白水平普遍较低。早期在衣藻叶绿体中表达的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）和Renilla荧光素酶报告蛋白在高内源蛋白背景下几乎检测不到。影响莱茵衣藻叶绿体外源基因表达和蛋白积累的因素包括启动子、5′-UTR和3′-UTR，以及根据莱茵衣藻叶绿体基因组偏好性进行基因优化。

叶绿体基因的转录和表达主要取决于启动子和5′-UTR。外源基因的转录和表达需要来自莱茵衣藻叶绿体基因组的内源启动子。叶绿体内源基因（如atpA、psbA和psbD）的启动子通常用于调节外源基因的表达。研究发现atpA启动子对unid基因的表达效果最好，而psbA启动子几乎无效。另有研究发现psaA-exon1启动子在调节vap A和acr V基因表达方面比atpA和psbA更强。本研究证实atpA启动子可有效调节莱茵衣藻叶绿体中ORF2基因的转录和表达。

其他调控因素，如来自莱茵衣藻叶绿体基因组的内源基因的5′-UTR，也影响外源基因的表达。研究发现5′-UTR对外源蛋白和mRNA积累的影响比3′-UTR更大，3′-UTR对mRNA和蛋白积累几乎无效。atpA和psbD基因的5′-UTR（包括启动子）产生最高水平的嵌合mRNA和蛋白积累，而rbcL和psbA基因的5′-UTR产生的mRNA和蛋白较少。本研究显示atpA基因的5′-UTR与atpA启动子融合可有效驱动莱茵衣藻叶绿体中mRNA和蛋白的积累。

莱茵衣藻叶绿体基因组显示高腺嘌呤和胸腺嘧啶含量，高达66.3%，且80%的密码子第三核苷酸包含腺嘌呤或胸腺嘧啶。据报道，在衣藻叶绿体中表达的GUS结构基因（uidA）和Renilla荧光素酶报告基因的表达水平在高内源蛋白背景下几乎检测不到。研究表明莱茵衣藻叶绿体基因组中的密码子偏好性可能是外源基因在莱茵衣藻叶绿体中低表达的原因之一。为实现蛋白表达，根据莱茵衣藻叶绿体基因组的偏好性优化了ORF2基因序列，从而有效表达了Cap蛋白。