肾移植排斥中衰老巨噬细胞的鉴定与表征：跨物种多组学揭示其致病机制与治疗潜力

本研究通过整合临床队列、大鼠模型及跨物种单细胞转录组数据，首次鉴定肾移植排斥中应激诱导的衰老浸润巨噬细胞（SnIMs），揭示其通过NF-κB/Cebpb通路驱动衰老相关分泌表型（SASP）并介导T细胞炎症应答，证实SnIMs浸润水平与Banff病变分级及移植物存活显著相关，为靶向衰老免疫细胞改善移植预后提供新策略。

　　

背景：同种异体移植排斥仍是影响移植物长期存活的主要障碍。细胞衰老（CS）参与移植物损伤，但免疫细胞衰老在排斥中的作用尚不明确。

方法：研究整合肾移植活检队列和年龄匹配大鼠移植模型的微阵列数据，通过免疫细胞浸润算法和组织病理学鉴定主要衰老免疫亚群，利用跨物种单细胞转录组学识别新型衰老浸润巨噬细胞（SnIMs）并在大鼠模型中验证，最后在肾移植数据集中评估SnIMs的临床价值。

结果：排斥移植物中CS基因集显著富集，且与移植物丢失和病理损伤相关。同种免疫反应放大应激诱导的衰老，其中p21⁺巨噬细胞成为重要的衰老免疫亚型。单细胞分析显示SnIMs表现出细胞周期阻滞、衰老相关分泌表型（SASP）上调，以及由NF-κB/Cebpb驱动的跨物种保守转录特征。这些细胞在排斥过程中沿伪时间轨迹积累，并通过CXCL趋化因子与效应T细胞相互作用。临床分析表明SnIMs浸润可预测T细胞介导的排斥（TCMR），并与Banff病变分级和不良移植物存活相关。

材料与方法：研究整合GEO数据库中肾移植转录组数据集，包括预后队列（GSE21374）和Banff队列（GSE98320）。单细胞数据涵盖小鼠和人类移植样本，采用Seurat进行质控、标准化和聚类分析。通过SenMayo和Martina衰老特征评分（SnCIT工具）鉴定衰老细胞，并结合细胞周期分析、差异基因表达和转录因子富集（Metascape）验证。动物模型采用SD-to-Wistar大鼠同种移植（Allo）和SD-to-SD同系移植（Syn），术后7天采集组织进行组织学（H&E、SA-β-gal染色）和分子分析（免疫荧光、IHC、RNA-seq）。统计采用R和GraphPad Prism，显著性阈值α=0.05。

结果1：肾移植排斥中的细胞衰老表型

临床队列分析显示排斥样本中CS基因集（如REACTOME: CELLULAR SENESCENCE、GOBP: CELL CYCLE ARREST）显著富集，且与常规排斥基因 panel（B-HOT）重叠度低，提示衰老机制独立于经典排斥通路。经典衰老标志物CDKN1A（p21）及SASP组分（IL1B、IL6、CCL2、CXCL1）在排斥组中上调，CS评分升高与移植物丢失风险相关。在Banff队列中，CS评分在TCMR和混合排斥样本中显著升高，且与间质炎症（i）、血管炎（v）、肾小管炎（t）等病变分级呈正相关。

结果2：应激诱导衰老在排斥中的加剧

年龄匹配大鼠模型排除供受体年龄和保存时间等混杂因素。同种移植组（Allo）表现出更严重的急性排斥损伤和衰老特征：SA-β-gal染色增强，Cdkn1a（p21）及SASP基因表达上调（而Cdkn2a/p16无显著变化），p21蛋白在肾小管周围区域富集。双标免疫荧光显示Allo组中p21⁺Cd45⁺免疫细胞显著增多，而p21⁺Lrp2⁺肾小管细胞无差异，表明衰老主要由浸润免疫细胞驱动。

结果3：巨噬细胞衰老是免疫衰老的核心组分

免疫浸润分析（ssGSEA）显示CS评分与效应免疫细胞（如CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、NK细胞、巨噬细胞）浸润水平正相关，其中与M1巨噬细胞相关性最高（R=0.73）。实验验证显示Allo组中CD68⁺p21⁺巨噬细胞共定位显著增加，提示促炎M1巨噬细胞是重要的衰老免疫群体。

结果4：衰老巨噬细胞的跨物种鉴定

单细胞分析（小鼠和人类数据集）揭示浸润巨噬细胞（IMs）中存在Cdkn1a⁺ SnIMs亚群，表现为G1/S期细胞周期阻滞、衰老通路（如GOBP: SIPS、REACTOME: SASP）激活，以及特征基因上调：细胞周期抑制剂（Cdkn1a、Cdkn1b、Gadd45b）、SASP组分（Cxcl10、Il1b、Cxcl2）、抗凋亡因子（Bcl2a1b）和衰老表面标记（Icam1、Cd274/PD-L1、Plaur/uPAR）。转录因子预测提示NF-κB家族（Nfkb1、Rela、Ikbkb）和Cebpb为关键调控因子。跨物种保守签名（14个基因）在人类样本中验证，且与体外M1极化巨噬细胞的瞬时激活模式不同，支持SnIMs的特异性衰老状态。大鼠模型的多重免疫荧光证实Cd68⁺p21⁺uPAR⁺Nfkb⁺衰老样巨噬细胞位于血管周围和肾小管间质区域，形态增大且不规则，SnIMs签名基因在Allo组中表达上调。

结果5：衰老巨噬细胞的动态积累与细胞互作

Cytotrace2和Monocle2轨迹分析显示SnIMs分化潜能降低且聚集于轨迹末端，表明其在排斥进程中逐渐积累。CellChat分析发现SnIMs与管状上皮细胞通过Mif-(Cd74+Cd44)和Spp1-(Itga4+Itgb1)轴招募至肾小管周围，并通过CXCL9/CXCL10-CXCR3和CXCL16-CXCR6途径与CD4⁺/CD8⁺ T细胞相互作用，维持炎症微环境。该互作模式在小鼠和人类数据集中均保守。

结果6：SnIMs浸润的临床意义

临床队列中SnIMs高浸润与移植物存活率降低显著相关（p<0.0001），且在TCMR和混合排斥中富集程度更高（AUC=0.78）。SnIMs水平与Banff病变评分（i、v、t、ci、ct）呈阶梯式正相关，提示其可作为急性/慢性移植物损伤的生物标志物和治疗靶点。

讨论：肾移植中细胞衰老受多种因素影响（如年龄、缺血再灌注损伤、alloimmunity），本研究聚焦排斥与衰老的交互作用。同种免疫反应作为应激源加剧IRI initiated衰老进程，其中巨噬细胞易受“DAMP-衰老”循环影响（DAMP-TLR通路激活SASP，SASP组分刺激DAMP释放，DAMP放大炎症和排斥），形成自放大环路。SnIMs通过抗凋亡（BCL-2家族）和免疫检查点（PD-L1）实现持久存活，并通过SASP（尤其CXCL趋化因子）招募T细胞，介导急慢性损伤。靶向清除衰老细胞（如ABT-263）可能改善移植预后。研究局限性包括衰老诱导通路在TCMR/AMR中的差异未阐明、SnIMs与T细胞互作机制需实验验证，以及衰老签名与炎症激活部分重叠的问题。

结论：研究证实应激诱导的SnIMs在肾移植排斥中具有关键致病作用，其跨物种保守特征和临床关联性为开发衰老靶向治疗提供了新视角。