RabA2b定位于胞间连丝的新发现及其在渗透胁迫下维持共质体水分运输的功能机制

本研究发现拟南芥Rab小GTP酶家族成员RabA2b首次被证实定位于胞间连丝（PD），其过表达能增强共质体染料HPTS的跨细胞运输能力。在渗透胁迫下，RabA2b分布于赫chtian strands（HS）及HS-细胞壁锚定位点，提示其可能通过调控PD通透性参与水分胁迫下的膜修复与共质体完整性维持。

　　

引言

胞间连丝（Plasmodesmata, PD）是贯穿相邻植物细胞壁的微通道，通过连接两个细胞的质膜（PM）形成共质体（symplast）连续性结构。这种细胞质连续性允许水分子和小分子物质（<1 kDa）在细胞间自由扩散，同时也能通过精密调控的机制实现大分子的细胞间运输。PD由融合相邻细胞PM的鞘状结构构成，其内部存在由内质网（ER）突起形成的链管（desmotubule），从而将两个细胞的ER系统相连。PD与内膜系统的连接为细胞间运输提供了多重通路，其在植物生长发育、初级与次级代谢以及生物胁迫响应中具有关键作用。

多种膜蛋白（如胼胝质合成酶、细胞表面受体和PD定位蛋白家族PDLPs）已被证实靶向PD并调控其通透性。此外，一些膜锚定和细胞骨架调控蛋白也参与PD功能。然而，这些蛋白向PD输送的具体机制仍不明确。

Rab小GTP酶是囊泡运输的关键调控因子。拟南芥Rab超家族包含57个成员，分为8个亚族（A–H），其中RabA亚族成员最多（26个），参与PM运输和细胞壁（CW）代谢。尽管最近在杨树和拟南芥的PD富集蛋白组中鉴定出多个Rab成员，但它们在PD中的定位尚未得到验证。

方法

本研究使用组成型表达RabA2b:GFP或共表达RabA2b:GFP与PIP2A:mCherry的转基因拟南芥植株（Col-0背景）进行共定位分析。6天龄幼苗经750 mM蔗糖溶液处理5分钟（室温）以诱导质壁分离，随后通过共聚焦显微镜观察。PD胼胝质染色采用苯胺蓝（Aniline blue, AB）法，固定叶片后以AB溶液孵育，并通过共聚焦显微镜成像。共质体运输实验使用膜不透性染料HPTS（8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid），将含有HPTS的琼脂块与下胚轴接触，加载30分钟后洗涤，10分钟后通过共聚焦显微镜检测染料迁移距离。所有图像使用Zeiss LSM 700共聚焦显微镜获取，并通过Zen black软件和Fiji进行图像处理与强度分析。

结果

RabA2b在PM上的空间分布

共聚焦显微镜分析显示，RabA2b:GFP与PM标记蛋白PIP2A:mCherry的重叠系数高达0.98，表明RabA2b可运输至PM。强度分布分析显示，RabA2b:GFP在PM上呈点状分布，形成高强度荧光峰，而PIP2A:mCherry信号则均匀分布。Z-stack最大强度投影及2.5D强度投影进一步证实细胞质和PM周边存在密集的GFP斑点。在幼嫩根细胞的分裂过程中，RabA2b:GFP强烈富集于细胞板，细胞分裂完成后则分布于新形成的PM边缘。由于初级PD形成于细胞板，这一现象提示RabA2b可能参与初级PD的形成和胞质分裂。

渗透胁迫下RabA2b的定位

在严重质壁分离条件下，原生质体收缩并与CW分离，PM形成Hechtian strands（HS）并与CW在PD或其他锚定位点保持连接。渗透胁迫处理后，共聚焦图像显示RabA2b:GFP信号分布于HS-CW锚定位点（推测为PD位点）以及整个HS结构，表明RabA2b与PD和HS密切相关。

RabA2b与PD胼胝质染色的共定位

AB染色显示，叶片表皮细胞中蓝色（胼胝质）、绿色（RabA2b:GFP）和红色（PIP2A:mCherry）荧光信号完全重叠于PM上的点状结构。强度分析显示，绿色和蓝色荧光强度在六个点状位点完全重叠，且每个蓝色荧光点均对应一个绿色荧光峰，而mCherry信号在整个分析区域内保持恒定。PD数量统计表明，RabA2b过表达株系与野生型的PD密度无显著差异。

RabA2b过表达对PD通透性的影响

HPTS迁移实验显示，RabA2b过表达株系（OE 6.4和OE 11.4）的染料迁移距离显著长于野生型，表明PD通透性增强。下胚轴细胞中，RabA2b:GFP以点状模式分布并与PIP2A:mCherry信号重叠，进一步证实其PM定位。

讨论

本研究首次证实RabA2b定位于PD，并发现其过表达可增强共质体运输能力。RabA2b在PD蛋白组中的鉴定及其与PDLP5的相互作用提示其可能通过直接调控PD通透性或通过输送细胞壁物质及相关酶类影响PD功能。在渗透胁迫下，RabA2b分布于HS及HS-CW锚定位点，表明其可能参与膜修复与张力调节，以维持共质体完整性。RabA2b在水分胁迫下的功能为作物抗逆研究提供了新方向。