电泳沉积锶掺杂硅酸钙涂层对钛的促成骨效应研究

本研究通过溶胶-凝胶结合电泳沉积技术，在钛表面成功构建不同锶（Sr）掺杂浓度（0.05、0.10、0.20 mol）的硅酸钙（CaSiO3）涂层。系统评估发现0.10 mol Sr组具有最优表面结构、Ca/P比（1.73）及持续Sr2+释放能力，可显著促进成骨细胞增殖、分化、矿化结节形成，并激活Wnt/β-catenin通路，为钛植入体表面功能化提供了创新策略。

　　

2 Materials and methods

2.1 Sample preparation

采用溶胶-凝胶法制备锶掺杂硅酸钙（Sr-CaSiO₃）粉末。以硝酸锶（Sr(NO₃)₂）和四水合硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）作为锶源和钙源，正硅酸乙酯（TEOS）作为硅源，硝酸（HNO₃）作为催化剂。按Ca(NO₃)₂/Sr(NO₃)₂/TEOS摩尔比x:(1-x):1（x=0, 0.05, 0.1, 0.2）配制溶液，经水解、凝胶化、冷冻干燥后，于900°C煅烧2小时获得粉末。纯钛基材经抛光清洗后，采用电泳沉积（EPD）技术（40 V，5分钟）将涂层均匀沉积于钛表面。

2.2 Characterization of the physical and chemical properties of the coating surface

利用X射线衍射（XRD）分析相组成，扫描电子显微镜（SEM）观察表面形貌，能量色散X射线光谱（EDS）表征元素分布。

2.3 Ion release study

将涂层样品浸入α-MEM培养基，通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量不同时间点（0.5、1、2、4、7天）的Sr²⁺释放浓度。

2.4 In vitro formation of hydroxyapatite

样品浸泡于模拟体液（SBF）7天，通过SEM和EDS评估羟基磷灰石（HA）形成能力。

2.5 Cell culture

采用小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1，在含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM中培养，成骨诱导培养基添加β-甘油磷酸和抗坏血酸。

2.6 Cell proliferation assay

使用CCK-8试剂盒检测细胞在第1、3、7天的增殖活性。

2.7 Quantitative qT-PCR

提取总RNA，通过qRT-PCR检测成骨相关基因（ALP、OCN）表达，以β-actin为内参，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。

2.8 Western blot analysis

提取总蛋白，通过Western blot检测Runx-2和ALP蛋白表达水平。

2.9 Alkaline phosphatase (ALP) staining and alizarin red staining

分别于成骨诱导14天和21天后进行ALP染色和茜素红（ARS）染色，观察早期分化及晚期矿化情况。

2.10 ALP activity measurement

使用ALP活性检测试剂盒测定酶活性，并采用BCA法标准化至总蛋白含量。

2.11 Immunofluorescence staining

通过免疫荧光检测Osx和β-catenin的表达与定位，DAPI复染细胞核。

2.12 Data analysis

所有数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学处理，以p < 0.05为显著差异。

3 Results and discussion

3.1 Preparation and phase composition of Sr-Doped calcium silicate coatings

XRD分析显示，0.05 mol Sr组主要相为Ca₃SiO₅，而0.10 mol和0.20 mol Sr组主导相转变为CaSiO₃，且CaSiO₃特征峰向高角度偏移约0.47°，证实Sr²⁺通过等价置换进入晶格引起晶格膨胀。未检测到SrO等二次相，表明Sr均匀掺杂于硅酸钙结构中。

3.2 Morphology of Sr-doped calcium silicate coating

SEM显示，未掺杂组（0 mol Sr）涂层由不规则颗粒松散堆叠，存在明显孔隙。0.05 mol Sr组出现板状或块状大颗粒（4-10 μm）。0.10 mol Sr组颗粒呈近球形，表面覆盖纳米纤维状“绒毛”，具有高比表面积和氧富集特性。0.20 mol Sr组出现大颗粒和孔洞缺陷，均匀性下降。EDS证实Sr含量随掺杂浓度增加而升高（0.05 mol: 1.9%，0.10 mol: 2.8%，0.20 mol: 4.6%）。

3.3 Formation of apatite on Sr-Doped calcium silicate coated titanium substrates

S浸泡7天后，未掺杂组Ca/P比为4.78，远高于羟基磷灰石（HA）理想值（1.67），矿化能力弱。0.05 mol和0.10 mol Sr组Ca/P比均优化至1.73，硅含量显著降低，表面形成纳米纤维结构，促进HA前驱体成核。0.20 mol Sr组Ca/P比略降至1.71，但结构缺陷影响沉积均匀性。

3.4 Surface roughness and Sr²⁺ release behaviour

0.10 mol Sr组具有适中的表面粗糙度（Ra），利于活性位点形成。Sr²⁺释放呈现双相特征：前2天快速释放，之后至第7天持续释放，提供早期成骨激活和长期生物活性支持。

3.5 Different concentrations of Sr-doped calcium silicate coatings can promote osteogenesis in vitro

CCK-8表明Sr掺杂未显著影响MC3T3-E1细胞增殖，显示良好生物相容性。ALP染色及活性检测显示，0.10 mol Sr组早期成骨分化活性最强。ARS染色表明，0.10 mol Sr组钙结节沉积致密均匀，矿化能力最优，0.20 mol Sr组因结构缺陷矿化水平略有下降但仍显著高于未掺杂组。

3.6 Sr enhances β - catenin nuclear translocation

Western blot和qPCR结果显示，0.10 mol Sr组Runx-2、ALP（蛋白和mRNA）及OCN表达均最高。免疫荧光证实，0.10 mol Sr组显著增强β-catenin核转位和Osx核定位，激活Wnt/β-catenin信号通路。

4 Conclusion

通过溶胶-凝胶辅助电泳沉积技术在钛表面成功制备了Sr掺杂CaSiO₃涂层。0.10 mol Sr浓度涂层在形貌均匀性、Sr²⁺释放动力学及生物活性间达到最佳平衡，显著增强ALP表达、矿化结节形成及成骨信号通路激活。该研究为改善钛植入体骨整合提供了有效的表面功能化策略，但需进一步开展体内实验验证其成骨效能、生物安全性及长期机械稳定性。