Atf3缺失通过激活Rap1信号通路促进胚胎干细胞向内皮细胞分化及功能成熟的新机制

本研究揭示了转录因子Atf3（activating transcription factor 3）在胚胎干细胞（ESCs）向内皮细胞（ECs）分化过程中的关键负调控作用。通过CRISPR-Cas9技术敲除Atf3基因可显著促进中胚层分化并激活Rap1信号通路，进而增强内皮细胞的分化效率和功能成熟（如LDL摄取和NO生成）。该发现为缺血性疾病（如心血管疾病）的细胞治疗提供了新的靶点和策略。

　　

Atf3调控胚胎干细胞向内皮细胞分化的机制

背景

缺血性疾病已成为全球健康的主要威胁，内皮细胞（ECs）损伤与其发病机制密切相关。针对内皮修复的细胞治疗策略备受关注，但临床级ECs的获取仍面临挑战。Atf3（activating transcription factor 3）作为AP-1转录因子家族成员，在应激响应和细胞分化中发挥重要作用，但其在ECs分化中的具体功能尚不明确。

方法

研究利用CRISPR-Cas9技术构建Atf3基因敲除（Atf3KO）的小鼠胚胎干细胞（mESCs）模型。通过悬滴法诱导胚胎体（EBs）形成，并采用RNA测序、Western blot、免疫荧光染色、流式细胞术和RT-qPCR等技术评估分化过程中内皮标志物的表达变化。功能分析包括LDL（低密度脂蛋白）摄取和NO生成检测。通过生物信息学分析RNA测序数据探索潜在分子机制。

结果

Atf3表达动态与基因敲除验证

单细胞RNA测序分析显示，Atf3在内皮细胞中显著富集，且表达随内皮成熟进程逐步升高。在野生型（WT）mESCs分化过程中，Atf3表达呈先下降后上升的趋势。成功构建Atf3KO细胞系并通过测序、PCR、Western blot和免疫荧光验证敲除效率。Atf3KO不影响细胞活力或多能性标志物（Oct4、Sox2、Nanog、Esrrb）的表达。

Atf3KO促进中胚层分化

在分化第3天和第6天，Atf3KO显著上调中胚层标志物（T、Mixl1、Eomes）、侧板中胚层标志物（Hand1）、心源性中胚层标志物（Mesp1）及轴旁中胚层标志物（Tbx6）的表达。中间中胚层标志物Pax2在第3天上调但第6天下调。内胚层标志物Foxa2在第6天上调，而Sox17无显著变化；外胚层标志物Sox1在第3天下调，Pax6和Nestin无变化。表明Atf3缺失主要促进中胚层定向分化。

Atf3KO增强内皮谱系分化

Atf3KO细胞在内皮祖细胞标志物（Vegfr2、Cd34、Etv2）和成熟内皮标志物（Cd31、Enos、Tie2、Flt1、Cdh5、Vwf）的表达均显著上调。Western blot和免疫荧光证实Cd31蛋白表达升高，流式细胞术显示Cd31⁺和Cdh5⁺细胞比例及荧光强度显著增加。在OG2背景mESCs中验证了结果的一致性。

功能成熟度提升

分化第9天，Atf3KO来源的ECs表现出更强的NO生成能力和LDL摄取能力，荧光强度定量分析证实其功能成熟度显著优于WT细胞。

RNA测序揭示信号通路调控

RNA测序发现Atf3KO导致分化第6天和第9天差异表达基因（DEGs）显著增加。Gene Ontology和KEGG分析显示，DEGs富集于血管生成、心脏形态发生和中胚层发育等相关通路。Gene Set Enrichment Analysis进一步证实Notch、Apelin和Rap1信号通路均被激活。

Rap1信号通路的关键作用

RT-qPCR显示Rap1a和Rap1b表达趋势上升。使用Rap1特异性激动剂（8-pCPT-2′-O-Me-cAMP-AM）和抑制剂（ESI-09）处理细胞，发现激动剂可促进WT细胞的内皮分化（Cd31蛋白表达升高、细胞连接增强），而抑制剂抑制Atf3KO细胞的内皮发育。下游内皮标志物（Vegfr2、Cdh5、Vwf、Tie2）的表达受Rap1通路调控，证实Atf3通过调节Rap1信号通路影响内皮分化。

讨论

本研究首次阐明Atf3在mESCs向内皮分化过程中的负向调控作用。Atf3缺失通过激活Rap1信号通路，促进中胚层定向和内皮细胞功能成熟，为心血管疾病的细胞治疗提供了新靶点。未来研究需在动物模型中验证分化ECs的治疗功能，并深入探索内皮亚谱系的调控机制。

结论

Atf3是mESCs向内皮细胞分化的关键负调控因子。Atf3KO通过激活Rap1信号通路促进中胚层分化和内皮发育，为血管再生医学提供了新的理论基础和治疗策略。