多卤代咔唑通过扰乱液相分离（LLPS）损害多巴胺能神经元：基于秀丽隐杆线虫模型的神经毒性机制研究

本文揭示了一种新兴有机污染物多卤代咔唑（PHCZ）通过干扰α-突触核蛋白（α-syn）的液-液相分离（LLPS），降低其凝聚物流动性，并激活内质网未折叠蛋白反应（UPRER）和线粒体功能障碍，从而导致多巴胺能神经元退行性病变。研究以秀丽隐杆线虫（C. elegans）为模型，在环境相关浓度下证实了PHCZ的发育与生殖毒性，并首次系统阐明其通过破坏蛋白质稳态和细胞器功能诱发神经毒性的双重机制，为有机污染物的健康风险评估提供了新视角。

　　

引言

多卤代咔唑（PHCZs）作为一类具有持久性、生物累积性和类二噁英特性的新兴有机污染物，近年来因其广泛的环境分布和潜在生态风险受到高度关注。这类化合物已在全球水体（包括湖泊、河流和海洋）及饮用水源中被检测到，其中中国武汉饮用水中的总浓度高达53.48 ng L^?1。既往毒理学研究多集中于水生动物模型，发现PHCZs可导致发育异常、心血管毒性、肝毒性及内分泌干扰，但其神经毒性机制尚未明确。值得注意的是，在金鱼脑中观察到最高水平的PHCZ富集，斑马鱼早期暴露于3,6-二溴咔唑（3,6-BCZ）后出现运动神经元轴突长度和数量减少，游泳能力受损。此外，人体尿样中检出PHCZ进一步凸显其潜在神经毒性风险。

液-液相分离（LLPS）是生物大分子（如蛋白质、核酸）在细胞内形成浓缩液滴状无膜细胞器的生物物理过程，其异常与多种疾病相关。帕金森病（PD）相关蛋白α-突触核蛋白（α-syn）的LLPS及液-固相转变可形成淀粉样纤维 hydrogel，加剧聚集并形成路易体，推动PD进程。环境污染物（如纳米颗粒、重金属）已被证实可加剧α-syn聚集，但小分子有机污染物如PHCZ对LLPS的干扰作用尚未被探索。

内质网（ER）是负责蛋白质折叠、脂质合成和钙稳态的关键细胞器，其功能紊乱会导致未折叠蛋白积累，引发内质网应激（ER stress）并激活未折叠蛋白反应（UPR）。UPR^ER通过IRE-1、PERK和ATF-6三条平行通路恢复稳态，但持续激活可能诱发凋亡。线粒体作为能量生产和代谢调控中心，其功能障碍（如膜电位丧失、氧化应激）与神经退行性疾病密切相关。PHCZ在斑马鱼中可诱导线粒体损伤，但其在神经元中的具体机制仍有待阐明。

PHCZ在秀丽隐杆线虫中的一般毒性

研究使用环境相关浓度（5–500 ng g^?1）的PHCZ处理秀丽隐杆线虫，发现其可显著缩短寿命，引起发育延迟，并降低繁殖力（窝仔数减少）。值得注意的是，5 ng g^?1低浓度处理延长了生殖周期，呈现激素效应特征，而50 ng g^?1及以上浓度则导致精子形态异常（伪足结构畸变），提示生殖毒性主要源于精子缺陷而非卵母细胞。代谢组学分析显示，PHCZ显著扰动吲哚及其衍生物代谢（如吲哚-3-乙酸水平下降约十倍），但aryl hydrocarbon receptor（AHR）同源基因ahr-1的突变或RNA干扰并未缓解发育毒性，表明PHCZ的毒性作用独立于经典AHR通路。

转录组分析进一步揭示，50 ng g^?1 PHCZ引起73个差异表达基因（DEGs），而500 ng g^?1处理导致3217个DEGs，其中细胞色素P450家族基因（如cyp-13、cyp-35）显著上调。cyp-13 RNAi加剧了PHCZ诱导的发育缺陷，证实其在解毒过程中的关键作用。这些发现表明，PHCZ在环境相关浓度下即可通过非AHR依赖途径引发健康风险。

PHCZ诱导多巴胺能神经元退变并促进α-突触核蛋白病理聚集

RNA-seq通路富集分析显示，PHCZ暴露后轴突再生相关通路被激活，提示潜在神经毒性。表型分析发现，500 ng g^?1 PHCZ处理导致多巴胺能神经元（CEP神经元）胞体丢失和轴突变性（如囊泡、断裂），而血清素能神经元（NSM神经元）形态完好。在人源SH-SY5Y细胞中，PHCZ暴露增加calcein-AM荧光（膜通透性改变）并减少Ki67阳性细胞（增殖抑制），进一步支持其神经毒性。

机制上，PHCZ显著促进α-syn的LLPS凝聚：在表达人源α-syn的线虫肌肉细胞中，PHCZ处理增加年龄依赖的凝聚物形成；在多巴胺能神经元表达α-syn的品系中，加速神经元退变。分子对接预测PHCZ与α-syn结合能约为-3（Vina score），表明中等亲和力。体外实验证实，PHCZ降低α-syn形成LLPS的浓度阈值，并通过荧光漂白恢复（FRAP）实验证明其降低凝聚物流动性（高浓度处理导致不可逆固化）。体内FRAP同样显示PHCZ处理降低α-syn凝聚物流动性，提示PHCZ通过促进液-固相转变加剧病理聚集。

PHCZ通过Ire-1激活内质网未折叠蛋白反应（UPR^ER）

鉴于LLPS在维持蛋白质稳态中的核心作用，研究评估了PHCZ对细胞应激通路的影响。发现PHCZ特异性激活UPR^ER（hsp-4::GFP报告基因上调），而非线粒体UPR（UPR^mito）或胞质应激反应。 epistatic分析表明，PHCZ诱导的UPR^ER依赖于ire-1通路，而pek-1和atf-6通路未参与。功能上，ire-1 RNAi上调α-syn::EGFP表达并加剧其凝聚，且PHCZ在ire-1缺陷背景下无叠加效应，表明PHCZ通过抑制ire-1介导的UPR^ER通路促进α-syn病理凝聚。在人源SH-SY5Y细胞中，50 μM PHCZ诱导IRE1α磷酸化，证实该机制在哺乳动物中的保守性。

PHCZ损害线粒体完整性

线粒体功能障碍是PD的重要驱动因素。PHCZ暴露显著降低线粒体膜电位（TMRE染色），但未引起ROS升高或mtDNA/nDNA比值改变。蛋白质印迹显示电子传递链（ETC）复合物蛋白水平差异变化，其中复合物II突变体mev-1与PHCZ处理产生协同发育延迟效应，提示PHCZ可能靶向复合物I破坏电子传递。长寿相关基因（如daf-2、daf-16、aak-2、pmk-1）突变未改变PHCZ毒性，进一步凸显线粒体特异性。电镜观察证实PHCZ引起线粒体结构破坏。抗氧化剂（维生素C、N-乙酰半胱氨酸、番茄红素）处理未能挽救膜电位丧失或神经元退变，表明氧化应激非主要机制。

在哺乳动物细胞中，PHCZ降低线粒体膜电位（JC-1染色），并激活PINK1-Parkin线粒体质量控通路：在HeLa细胞中诱导Parkin线粒体转位和PINK1介导的Parkin磷酸化；在SH-SY5Y细胞中增加磷酸化泛素化蛋白水平。这些结果一致表明，线粒体功能损伤是PHCZ神经毒性的关键分子事件。

讨论

本研究系统揭示了PHCZ作为一种有机污染物，通过干扰α-syn的LLPS动力学、激活UPR^ER和破坏线粒体功能，诱导多巴胺能神经元退变的多重机制。与纳米塑料等颗粒污染物不同，PHCZ作为小分子化合物可直接穿透细胞膜，靶向胞内LLPS过程，凸显其独特毒性机制。网络毒理学分析将PHCZ预测靶点与PD基因集交集，富集于神经退行性变相关通路，且蛋白质-蛋白质互作（PPI）识别出以SNCA（α-syn）为中心的模块，与实验结论高度一致。

这些发现不仅拓宽了对有机污染物神经毒性机制的理解，也为PD的环境病因学提供了新视角。LLPS调控异常可能成为污染物毒性评价的通用指标，而UPR^ER和线粒体功能则是关键毒理学靶点。未来研究需进一步探索PHCZ与其他病理性LLPS蛋白（如TDP-43）的相互作用，以及其在复杂环境混合物中的联合效应。