抗纤维化水凝胶集成微皮层脑电图阵列实现长期稳定的硬膜下记录

本研究报告了一种新型粘附性水凝胶集成微皮层脑电图（aGel-μECoG）阵列，通过采用亲水性聚乙烯醇和疏水性聚3-（三甲氧基硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯异质网络水凝胶，显著改善了脑组织相容性和粘附性（粘附强度达25.2±3.8 kPa）。该技术实现了无缝合植入，有效减轻了组织反应，在急性期阻抗增加降低20倍，并在16周内保持94.8%的稳态视觉诱发电位信噪比（SNR），为高性能神经接口提供了突破性解决方案。

　　

引言

皮层脑电图（ECoG）阵列在功能性皮层映射、癫痫监测和脑机接口（BCI）等领域应用日益广泛。硬膜下ECoG阵列在侵入性和高时空分辨率之间提供了良好平衡，但临床可用的宏观和中观尺度ECoG阵列存在空间分辨率有限（3.5-5 mm）和与大脑不规则表面非共形接触的问题。柔性薄膜μECoG设备成为有前景的替代方案，但其长期可靠性受到电极-组织界面不良组织反应的影响。

尽管具有灵活性，μECoG阵列（杨氏模量E > 1 GPa）与柔软脑组织（E < 30 kPa）之间的显著机械模量不匹配会诱发慢性炎症反应，包括胶质细胞活化、进行性胶质增生和纤维化囊形成。这些不良组织反应会导致阻抗波动、信号质量恶化，并可能导致设备功能障碍。此外，由于μECoG设备缺乏固有粘附特性，由身体运动和脑脊液（CSF）动力学引起的微尺度位移可能引入高空间分辨率记录的不稳定性。

水凝胶集成生物电子学的进展

水凝胶集成生物电子学为解决关键挑战提供了有前景的策略，包括改善机械模量、导电性、耐久性和粘附性，这些对于可靠和长期的生物接口应用至关重要。新兴的神经特异性设计，如高导电性卡拉胶互穿PDA-聚丙烯酰胺水凝胶集成ECoG阵列，表现出免疫侵入能力并提供可靠信号转导。

然而，将这些成功转化为神经接口需要更多 than 简单适应，因为脑组织具有独特的生理和机械复杂性。尽管取得了这些进展，这些系统主要依赖于化学修饰（如儿茶酚和N-羟基琥珀酰亚胺）进行组织粘附。虽然这些方法确保了牢固和永久粘附，但它们引起了关于化学污染和植入物移除过程中潜在损伤的担忧。

aGel-μECoG的设计与制备

本研究提出了aGel-μECoG神经接口，可减轻组织反应并确保长期信号稳定性。这种水凝胶集成神经接口应满足以下要求：i) 具有可逆键合的强大组织粘附，防止外植期间皮质损伤；ii) 具有高电保真度涂层，时空分辨率与其主体设备相当；iii) 最小化神经炎症和纤维化囊形成，实现体内持续性能。

aGel-μECoG由先前报道的亲水性聚乙烯醇（PVA）和疏水性聚3-（三甲氧基硅烷基）丙基甲基丙烯酸酯（PTPM）异质网络作为水凝胶粘附剂组成，高密度聚酰亚胺（PI）基μECoG阵列用于增强分辨率，以及电镀聚（3,4-乙撑二氧噻吩）：聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）层用于降低电化学阻抗。为确保强大的物理粘附，aGel-μECoG与生物组织进行干交联，实现紧密粘附以进行长期植入。

aGel制备与表征

aGel通过结合PVA和PTPM形成独特的亲水/疏水异质网络结构设计而成。选择PVA作为主要水凝胶基质是因为其生物相容性和生物粘附性。疏水PTPM的加入限制了PVA网络的过度膨胀，确保结构稳定性的同时保持有利的粘附特性。

由于疏水PTPM的加入，干燥aGel薄膜表现出比纯PVA薄膜更大的水接触角，同时总体上保持亲水性。水接触角测量进一步显示，水合aGel实现了介于PI和水合PVA之间的中间表面亲水性。aGel薄膜的拉伸测试展示了卓越的机械性能，包括高拉伸性（拉伸应变：555.1±25.8%）和韧性（断裂能：31.4±3.3 kJ m^-2）。aGel表现出109.4±19.5 kPa的超软杨氏模量，有效桥接了软脑组织和刚性聚酰亚胺基底之间的机械失配。

长期植入过程中水凝胶接口的一个重大挑战是过度膨胀引起的屈曲或起皱，这可能导致与生物组织或生物电子学的分层。膨胀测试显示在磷酸盐缓冲盐水（PBS，1X，pH 7.4）中浸泡180分钟后质量和体积膨胀比稳定（分别为143.8±6.3%和118.1±11.9%），表明aGel薄膜在生理环境中的稳定性。

体外生物相容性评估显示，aGel和PI与PVA相比表现出优异的抗蛋白质污染能力。使用NIH3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）进行的细胞毒性试验发现，与阴性对照培养基相比，aGel或PI提取物均无显著毒性。进一步评估aGel和PI支持NIH3T3细胞粘附和生长的能力，实验结果表明aGel具有低蛋白质吸附和弱细胞粘附生长能力，突出了其卓越的抗污染性能。

此外，aGel在400-800 nm波长范围内表现出高光学透明度，实现了潜在的光遗传学应用。其在PBS（1X）中浸泡后的离子电导率（1.99 S m^-1）与CSF密切匹配，支持其与电生理应用的兼容性。

aGel-μECoG制备与表征

为实现高灵活性和生物相容性，使用生物相容性PI作为基底制造了6 μm厚的μECoG阵列，具有10 nm/200 nm Ti/Au金属层用于导电性。64/1024通道电极的电化学性能通过用PEDOT:PSS电镀进一步优化。

为实现无缝设备集成，使用刮涂技术将aGel前体应用于μECoG阵列，确保均匀精确的层厚度，随后进行涉及光聚合和溶剂交换的两步原位凝胶过程。凝胶动力学得到良好控制，以防止aGel和μECoG设备之间的应变诱导变形或分层。阻抗和循环伏安法（CV）测量显示涂层后变化可忽略不计，PEDOT:PSS层上无可观察到的起皱。

为解决在湿滑生物组织上的粘附挑战，采用了干交联机制。与湿组织接触时，干燥状态的aGel-μECoG通过其亲水PVA网络快速吸收界面水，该过程立即与组织表面形成强氢键。PTPM网络进一步增强了结构稳定性和生物相容性，实现了对生物组织25.2±3.8 kPa的粘附强度。离体测试在啮齿动物脑组织和猪心组织上进行，进一步证实aGel-μECoG实现了强粘附和共形接触，并确保安全移除而不对多种组织造成损伤。

虽然高密度μECoG阵列以其卓越的信号质量和时空分辨率而闻名，但集成aGel层由于增加的源电极距离而引入了设计挑战，可能损害弱神经信号的信度。为应对这一挑战，使用计算模拟系统优化了aGel层的设计参数。构建了基于先前研究的五层啮齿动物头部模型，包括灰质、CSF、硬脑膜、颅骨和头皮，用于有限元（FE）模拟。

研究结果揭示了与理论体积传导模型一致的趋势。具体而言，aGel层的厚度和电导率都显著影响信号传播，更厚或更具导电性的层导致信号通信效率降低。整合研究结果，确定了超薄aGel层（约10 μm厚度，约2 S m^-1电导率）作为高电保真度的设计参数。制造过程进一步证实了实现薄至10 μm的超薄aGel层的可行性，验证了它们作为aGel-μECoG阵列操作窗口的适用性。

高分辨率功能性皮层映射中的信号保真度

为实验评估超薄aGel-μECoG阵列的信号保真度，使用高密度1024通道设备在麻醉大鼠中进行了功能性皮层映射。阵列制造在6 μm厚PI基底上，具有20 μm直径电极，间距200 μm，并用PEDOT:PSS电镀以降低电化学阻抗。

为检验这一假设并验证关于超薄aGel界面层电保真度特性的FE模拟结果，制备了三种设备配置：一种无aGel（μECoG），一种具有10 μm aGel（10-μm aGel-μECoG），和一种具有100 μm aGel（100-μm aGel-μECoG）。电表征显示，PEDOT:PSS涂层有效降低了阻抗并增强了所有配置的电荷存储能力。

为公平比较，在μECoG设备中加入了灌注孔以置换CSF并最小化源电极距离。设备顺序放置在麻醉大鼠的皮质表面上，从左初级体感皮层记录信号。通过使用一对26号双极针刺激右坐骨神经100 ms双相脉冲引发体感诱发电位（SSEP）。记录揭示了高度局部化、大幅度的SSEP，峰值响应在刺激后20-30 ms，与先前研究一致。

试验平均SSEP来自代表性测量，显示振幅与所有设备配置的刺激强度成比例增加。应用于每个刺激强度的归一化SSEP电位的未配对t检验显示，100-μm aGel-μECoG从100 μA刺激电流开始存在显著差异，表明可辨别反应的阈值。跨所有刺激条件的进一步分析显示，aGel厚度显著影响信号功率。事后Tukey检验显示μECoG和10-μm aGel-μECoG之间无显著差异。相比之下，100-μm aGel-μECoG表现出显著降低的信号功率。这一观察与计算模型预测一致，即厚aGel层可衰减信号传播。

为评估aGel厚度对空间分辨率的影响，分析了信噪比（SNR）的带通滤波空间图。这些图揭示了不同的活动模式，特别是在伽马（γ，30-70 Hz）和高伽马波段（高γ，70-190 Hz），证明了高密度aGel-μECoG记录高频振荡的能力。值得注意的是，高伽马波段激活与尖峰活动强烈相关，并表现出高空间特异性。

使用从静息状态记录的数据，通过幅度平方相干性跨增加电极间距离在不同频带量化了空间分辨率。数据拟合到指数衰减模型，其中λ表示空间分辨率的近似值。应用于每个频带空间分辨率的未配对t检验显示100-μm aGe-μECoG存在显著差异，表明跨所有检查频带的信号分散。双向ANOVA确认aGel厚度显著影响空间分辨率。虽然10-μm aGel-μECoG保持了与μECoG相当的分辨率，但100-μm aGel-μECoG显示出显著降低的空间分辨率。

这些实验结果与先前提出的设计原则很好地吻合，为模拟方法提供了稳健验证。它们还证明10-μm aGel-μECoG阵列可以实现与高密度μECoG相当的高分辨率功能映射，验证了它们用于高保真神经记录的潜力。

体内生物相容性评价

接下来，使用慢性硬膜下植入在大鼠模型中评估了aGel涂层设备的体内生物相容性。为最小化与连接器凹陷和植入物形状相关的不良组织反应，根据ISO 10993-6标准制造了4 mm圆盘形设备用于医疗器械的生物学评价。比较了两种设备配置，一种无aGel涂层，一种具有10 μm厚aGel涂层（分别称为-aGel和+aGel），以区别于64通道长期植入设备。

在植入后1、2、4和8周收集脑样本。亮场成像显示两组均无可视皮质损伤。为评估植入物下方脑组织中的神经炎症反应，使用了神经元（NeuN）、星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba1）的免疫荧光标记。表达水平归一化到对侧对照以最小化个体变异性。

为考虑细胞反应的区域差异，根据神经元密度和形态学将皮质分为三个区域：层I（L1）、上层（UL，层II-IV）和下层（LL，层V-VI）。NeuN染色显示在研究任何阶段，-aGel和+aGel组之间神经元密度无显著差异。定量分析显示，GFAP表达（指示星形胶质细胞活化）在植入后两周-aGel组的所有皮质区域显著更高。类似地，Iba1表达（小胶质细胞活化标志物）在-aGel组的所有皮质区域一周时和LL层两周时显著升高。四周后，两组之间标志物表达无显著差异。这些结果证明了aGel-μECoG设备的优异生物相容性，其特征在于比裸μECoG设备更弱的体内免疫反应。

为评估纤维组织生长程度，使用苏木精和伊红（H&E）染色检查了收集的组织样本。-aGel植入物在第二周显示大量纤维囊形成。值得注意的是，-aGel组在脑表面早在两周就形成松散结缔组织，与先前研究一致。还使用二次谐波生成（SHG）成像检查了外植设备的纤维组织封装。在-aGel圆盘上观察到强SHG信号和光学显微镜下可见的异物，表明显著的胶原积累和蛋白质吸附。相比之下，在+aGel圆盘上未检测到此类信号，表明优异的抗纤维囊形成能力。显微镜观察进一步证实，外植+aGel设备上的aGel涂层在所有时间点保持其结构完整性。第八周的代表性图像显示。此外，在-aGel设备上观察到大量吸附污染，而+aGel设备保持清洁。这些结果共同证明了aGel-μECoG在减轻脑内神经炎症和减少纤维组织形成方面的体内能力。

长期阻抗稳定性

电化学阻抗谱（EIS）是监测电极-组织界面动态的宝贵工具，具有体内阻抗谱与组织学变化之间的已建立相关性。先前关于长期表面电极植入的研究报告了初始快速阻抗增加，随后数月到数年逐渐稳定，反映了组织反应从急性期到慢性期的进展。

为评估aGel-μECoG的长期稳定性，采用了64通道μECoG阵列并慢性植入大鼠视觉皮层。比较了两种配置：无aGel的μECoG和具有10 μm界面aGel层的aGel-μECoG。电表征确认aGel层对PEDOT:PSS电镀μECoG的电特性影响最小。在60°C PBS（1X，pH 7.4）中进行的加速老化测试预测两种配置的等效功能寿命超过一年，突出了PEDOT:PSS层和aGel涂层在模拟生理条件下的耐久性。

在植入后前两周每三天测量一次电化学阻抗，随后每周或每两周测量一次。首先研究了1 kHz阻抗作为评估植入物和组织反应的快速常见指标。结果揭示了两种配置之间的显著差异。μECoG对照组表现出显著的阻抗变异性，其特征在于三个不同阶段，断点在第11天和第40天，使用广义加性模型（GAM）识别。观察到初始阻抗激增，随后逐渐下降并恢复到基线。本研究中观察到的阻抗波动反映了植入后电极-组织界面的动态生物过程，并与先前研究一致。

相比之下，aGel-μECoG电极在整个植入期间表现出显著的稳定性，阻抗始终保持在窄范围内（32.3±1.1 kΩ），表明更稳定的电极-组织界面。组织学和SHG成像显示蛛网膜和外植设备中最小纤维囊形成。

虽然单频阻抗测量为评估电极功能提供了便捷指标，但宽频谱EIS结合等效电路建模提供了对电极-组织界面组织反应的更全面理解。结合EIS与电路建模，发现μECoG组表现出恒定相位元件（Z_CPE）指数项α和Z_CPE中电容幅度的显著降低，表明界面向更具电阻特性的转变。相比之下，aGel-μECoG组的Z_CPE指数项α和电容幅度保持稳定两个月。此外，组织电阻R_T在急性期（<2周）在两组中迅速增加，但μECoG稳定在比aGel-μECoG组高两个数量级的阻抗（约1000 kΩ vs 约10 kΩ），这是由于形成导电性较差的封装层。此外，μECoG组稳定后较小的组织电容（C_T）也表明形成了更厚的封装层，这与组织学分析一致。这些结果强化了我们的发现，即aGel-μECoG在体内保持了稳定的电极-组织界面。

长期信号稳定性

具有明确模式的电生理信号，如视觉诱发电位、听觉诱发电位、感觉诱发电位和癫痫样信号，通常用于评估植入表面阵列的慢性稳定性。其中，稳态视觉诱发电位（SSVEP）提供了皮质活动的非侵入性和可靠测量，因为它们具有一致的反应和最小的训练要求。SSVEP引起视觉皮质的广泛激活，确保跨电极的均匀SNR。此外，SSVEP的SNR在频域中量化，因此不易受环境噪声影响。

类似于阻抗的长期评估，64通道aGel-μECoG和μECoG植入大鼠左视觉皮层。大鼠在记录期间头部固定并清醒，8 Hz闪烁灯位于眼睛前10 cm。光刺激以恒定强度传递，50%占空比以确保一致激活。SSVEP信号在前12周每周记录，之后每两周记录一次，最长16周。来自aGel-μECoG电极的代表性结果显示16周内信号幅度和功率谱稳定，具有以8 Hz及其相应谐波的独特峰为特征的周期性神经活动。当大鼠眼睛被覆盖时，这些频率特异性信号，特别是偶次谐波（如16和32 Hz）消失，确认视觉皮质是记录活动的起源。

为评估随时间推移的信号稳定性，在16周期间分析了五只大鼠每种设备类型在8 Hz的SNR。信号稳定性分析具有挑战性，因为电极-组织界面、个体受试者差异以及动物的注意力和生理状态存在潜在变异性。为应对这些混杂因素，采用了线性混合效应模型（LMM），将电极类型（μECoG vs aGel-μECoG）、植入后时间及其交互作用作为固定效应，同时将意外变异性作为随机效应。

LMM建模显示μECoG和aGel-μECoG具有相似的基线信号质量，证实了先前发现，即10 μm aGel涂层不改变信号质量。aGel-μECoG电极随时间保持一致趋势，预测SNR在植入后16周为94.8%。μECoG阵列表现出与aGel-μECoG阵列显著不同的SNR随时间趋势。发现μECoG表现出非线性SNR趋势，其特征在于初始下降，随后增加。使用最小均方误差方法，将数据分段为第七周之前和之后。分析揭示第七周前SNR显著下降（预测第七周SNR=69.5%），随后第七周后SNR显著增加（预测第七周SNR=65.4%，第十六周SNR=78.4%）。此外，电极内一致性分析显示aGel-μECoG电极表现出显著更低的8 Hz SNR变异系数，表明减少的SNR变异性和更均匀的电极-组织界面。

μECoG组观察到的信号质量波动和变异性可能由电极-组织界面的动态生物反应驱动。虽然阻抗在第11天后开始下降，但SNR下降持续到第七周，表明这两个指标之间的解耦。这些发现表明，由炎症和封装驱动的组织电阻率的局部变化是影响信号质量的潜在主导因素，这与先前研究一致。

在植入16周后，使用H&E染色检查脑组织，并使用亮场成像、碘化丙啶染色和SHG成像评估外植设备。μECoG设备在亮场成像下显示不透明、厚薄不均的纤维组织封装，SHG成像表明植入物周围强胶原积累。提取电极的碘化丙啶染色显示μECoG上显著增强的细胞封装，与SHG结果相关。H&E成像显示μECoG下方脑切片上形成厚纤维囊。相比之下，aGel-μECoG保持透明，设备或脑表面无检测到的纤维囊。H&E染色和碘化丙啶染色的统计分析显示，μECoG植入物下方脑表面和设备表面的纤维囊显著厚于aGel-μECoG。这种非均匀纤维囊可能是μECoG阵列信号波动和增加变异性的主要原因。研究结果表明，虽然两种电极类型表现出相似的基线性能，但aGel-μECoG电极在慢性植入期间表现出增强的纵向稳定性和空间一致性。这强调了它们对长期神经记录应用的适用性。

讨论

硬膜下ECoG阵列提供高空间和时间分辨率与卓越信号质量，使其成为神经接口的宝贵工具。然而，它们的长期植入通常导致电极-组织界面的神经炎症和纤维组织生长，导致进行性信号恶化。水凝胶基功能接口由于其固有生物相容性、机械顺应性和生物粘附性，在生物电子学中显示出潜力。

本研究开发了aGel-μECoG平台，将柔性、高密度μECoG阵列与超薄PVA/PTPM亲水/疏水异质网络集成。所得水凝胶表现出优异的抗膨胀性、机械顺应性（杨氏模量约109.4±19.5 kPa）和强大的生物粘附性（约25.2±3.8 kPa）。与构成化学污染和组织损伤潜在风险的化学键合粘附策略不同，采用了干交联氢键机制。方法实现了与脆弱脑表面的强健但可逆键合，确保机械稳定性的同时最小化组织损伤。

系统研究了水凝胶对信号通信的影响，并优化了其设计参数以实现高电保真度。高精度功能性皮层映射实验证实，优化后的aGel-μECoG保留了弱信号幅度并保持了亚毫米空间分辨率。长期植入研究证明了其减轻神经炎症和抑制纤维组织形成的卓越能力，与传统μECoG阵列相比，急性期阻抗增加减少20倍。此外，aGel-μECoG组保持稳定的SSVEP记录，16周内信噪比为94.8%，显著优于传统μECoG阵列。虽然本研究在啮齿动物模型中进行，但未来工作应探索该平台在大型动物模型和人体试验中的转化潜力，考虑皮质和硬脑膜解剖结构的生理差异。鉴于对开发可靠耐用硬膜下神经接口的日益增长兴趣，aGel-μECoG平台突出了增强可及神经修复技术和BCI系统的有前景策略。