人类膀胱体细胞突变选择中的性别与吸烟偏倚：正常尿路上皮克隆景观的深度解析

为解决膀胱癌风险因素（性别与吸烟）如何影响正常尿路上皮克隆演化的问题，研究人员开展超深双链DNA测序（~5,000×）研究，发现男性RBM10、CDKN1A和ARID1A基因截短突变阳性选择更强，吸烟者TERT启动子激活突变显著增加。这些发现揭示了癌症风险因素通过塑造正常组织克隆景观促进肿瘤发生的机制，为膀胱癌预防提供了新策略。

　　

膀胱癌作为一种常见的恶性肿瘤，展现出显著的流行病学特征：男性发病风险是女性的四倍，吸烟则是明确的危险因素。然而，这种风险差异背后的生物学机制至今未明。肿瘤发生由体细胞突变驱动，那么，正常膀胱中的克隆景观是否会因性别和吸烟史而不同呢？这成为了研究人员关注的焦点。

为了回答这个问题，一个国际研究团队对45名捐赠者的79个正常膀胱样本进行了超深双链DNA测序（平均深度约5,000×），覆盖了16个基因的111,876个碱基对。这项技术能够以超高灵敏度检测低频突变，相当于分析了约40万个单倍体基因组。研究发现，正常尿路上皮中存在数千个克隆驱动突变，其数量是膀胱肿瘤中检测到的16倍。

研究人员开发了新型计算方法Omega，通过dN/dS分析量化阳性选择强度。结果显示，13个基因（包括RBM10、KDM6A、STAG2等）在正常尿路上皮中受到阳性选择，而FGFR3的截短突变则表现出阴性选择。特别值得注意的是，TERT启动子的激活突变（在肿瘤中常见）也驱动了正常膀胱中的克隆扩增。

关键技术方法包括：从尸检获取的79个正常膀胱样本采集；超深双链DNA测序技术（平均深度5,164×）；新开发的deepUMIcaller突变调用流程；dN/dS分析框架Omega；以及混合效应线性模型统计分析。

性别偏见于膀胱克隆景观

研究发现男性在RBM10、CDKN1A和ARID1A基因的截短突变中表现出显著更强的阳性选择，这种差异在调整年龄、吸烟史、饮酒史、体重指数和化疗暴露后仍然存在。其中RBM10和STAG2位于X染色体，而CDKN1A和ARID1A位于常染色体。值得注意的是，膀胱肿瘤中RBM10和CDKN1A的截短突变也在男性中更为常见，这表明正常组织中的克隆选择差异与肿瘤中的突变模式存在对应关系。

TERT克隆与年龄和吸烟相关

研究发现TERT启动子激活突变（在肿瘤中观察到两次以上的突变）在老年捐赠者中更为常见。除一例外，所有TERT启动子激活突变都发生在55岁以上的捐赠者中。更重要的是，在这个年龄组中，有吸烟史的个体TERT启动子突变率显著更高。这种关联与性别、体重指数和化疗暴露无关。有趣的是，吸烟史与总体突变密度无关，表明烟草致癌物在膀胱肿瘤发生中可能主要通过促进突变克隆生长而非单纯增加突变率发挥作用。

自然饱和突变生成

研究提出了"自然饱和突变生成"的概念，通过超深测序正常组织中的大量克隆，能够直接评估基因中所有可能突变的功能影响。研究人员计算了在每个基因中观察到所有可能突变所需的测序深度，发现由于阳性选择的作用，实际观察到的突变积累速度比中性突变生成理论预测的要快。

以TP53为例，研究在79个样本中检测到了该蛋白394个氨基酸残基中230个（58%）的突变（错义或无义）。通过计算每个氨基酸残基的选择强度，发现最具选择性的位点主要集中在p53 DNA结合结构域，这些位点在肿瘤中更常见，被识别为癌症驱动因子的可能性更高，在实验性饱和突变检测中得分也更高。

研究还发现，在通常表现为阴性选择的FGFR3中，影响单个残基（G380）的突变却在正常尿路上皮中受到阳性选择，而这个残基并不对应于膀胱癌中最常见的三个FGFR3热点突变。

对于TERT启动子，在正常尿路上皮中具有显著位点选择性的突变在肿瘤中出现频率更高，并且总体实验功能影响值更高。

讨论与意义

这项研究展示了超深双链DNA测序技术（约40万个单倍体基因组）能够准确测量16个基因在79个个体样本中的阳性选择强度。研究发现男性在RBM10、ARID1A和CDKN1A截短突变中的阳性选择强度显著更高，且RBM10和CDKN1A突变在男性膀胱癌中也更为丰富。此外，研究还发现老年吸烟者TERT启动子突变大幅增加，这可能至少部分解释了吸烟与膀胱癌风险增加之间的关联。

研究提出的通过超深纠错双链DNA测序正常组织中大量克隆混合物来研究自然饱和突变生成的途径极具吸引力。研究表明，可以获得精细的选择强度图谱，显示在不同外部因素影响下，蛋白质各个位点或区域突变在整个正常组织发育过程中所受的选择程度。通过人体组织超深测序进行的饱和突变生成——个性化癌症医学的关键发展——为补充实验和计算机方法提供了一种经济有效的直接替代方案。

此外，表征不同基因和人体组织中阳性（和阴性）选择模式对于理解体细胞进化如何影响癌症风险至关重要。这些发现不仅揭示了膀胱癌风险因素的作用机制，还为其他肿瘤类型的研究提供了新的思路和方法。

该研究的技术优势在于其极高的检测灵敏度，错误率约为4×10^-8，比正常尿路上皮中的突变密度低两个数量级，确保了结果的可靠性。同时，研究还发现膀胱穹顶和三角区两个区域的进化动力学和选择力是等效的，表明从约2 cm²尿路上皮刷取的细胞能够很好地代表整个组织的克隆结构。

这项研究由Ferriol Calvet、Raquel Blanco Martinez-Illescas等研究人员共同完成，发表在《Nature》期刊上，为理解膀胱癌的发生机制和风险因素作用提供了重要见解，也为癌症预防和早期干预提供了新的思路。